Rapid host species identification from dried bloodspots of Culex mosquito blood meals using Mid-Infrared Spectroscopy

Resumen Técnico: Identificación Rápida de la Especie del Huésped en la Sangre de Mosquitos Culex mediante Espectroscopía de Infrarrojo Medio

Planteamiento del Problema
Comprender las preferencias de alimentación de sangre de los mosquitos es fundamental para inferir la dinámica de transmisión de patógenos transmitidos por vectores y optimizar las estrategias de intervención. Aunque los mosquitos Culex son vectores primarios de patógenos de alta prioridad multihuésped (p. ej., el virus de la encefalitis japonesa, el virus del Nilo Occidental, la filariasis), sus patrones de alimentación siguen siendo insuficientemente estudiados en comparación con géneros como Anopheles. El método actual de "estándar de oro" para identificar las fuentes de la ingesta de sangre —técnicas basadas en el ADN (PCR, secuenciación) y ensayos basados en antígenos (ELISA)— suele ser costoso, requiere mucho tiempo, demanda capacidad de laboratorio especializada y sufre una reducción en la precisión a medida que las ingestas de sangre se digieren o degradan. Existe una necesidad específica de una alternativa rápida, rentable y escalable que funcione eficazmente en entornos de bajos recursos y que pueda manejar muestras de especies de Culex, las cuales no han sido analizadas previamente utilizando este enfoque.

Metodología
El estudio empleó un enfoque de dos fases para desarrollar y validar un flujo de trabajo de Espectroscopía de Infrarrojo Medio acoplada con Aprendizaje Automático (MIRS-ML) utilizando Manchas de Sangre Seca (DBS, por sus siglas en inglés).

1. Desarrollo del Modelo de Laboratorio:

   • Generación de Muestras: Se alimentaron ejemplares de laboratorio de Culex quinquefasciatus con sangre de seis especies de huéspedes: humano, cerdo, pollo, ganado, perro y caballo. La sangre se recolectó mediante un sistema de alimentación por membrana utilizando sangre con anticoagulantes.
   • Creación de DBS: El contenido abdominal se extendió sobre tarjetas Whatman™ 903 Proteinsaver a las 6, 12, 24 y 30 horas post-alimentación para simular la digestión.
   • Espectroscopía: Las muestras se escanearon utilizando un espectrómetro de transformada de Fourier (FTIR) Bruker ALPHA (rango de 400–4000 cm⁻¹).
   • Procesamiento de Datos: Los espectros se preprocesaron para eliminar las regiones afectadas por el sustrato de la tarjeta (900–1100 cm⁻¹) y por el CO₂ atmosférico (1800–2200 cm⁻¹).
   • Aprendizaje Automático: Se probaron siete algoritmos de aprendizaje automático supervisado. Se seleccionó un Perceptrón Multicapa (MLP) como el modelo óptimo tras realizar una búsqueda de hiperparámetros mediante búsqueda de cuadrícula (grid search) y validación cruzada de 5 pliegues. El modelo fue entrenado con el 80% de los datos y validado con un 20% de datos de prueba retenidos.

2. Validación de Campo:

   • Recolección: Se recolectaron mosquitos con ingesta de sangre de sitios de campo en Filipinas (Luzón Central y Cordillera) y Australia (Queensland) utilizando trampas atraídas por CO₂.
   • Estándar de Referencia: La identificación del huésped para las muestras de campo se realizó mediante extracción de ADN, PCR de vertebrados universal (dirigido a COI) y secuenciación de Sanger.
   • Aplicación: El modelo MLP entrenado en el laboratorio se aplicó a los espectros FTIR de las DBS recolectadas en el campo para predecir la especie del huésped.
   • Umbral de Probabilidad: El estudio evaluó el uso de puntuaciones de probabilidad del modelo para filtrar las predicciones de baja confianza, con el objetivo de mejorar la precisión al excluir muestras inciertas.

Resultos Clave

• Desempeño en Laboratorio: El modelo MLP optimizado alcanzó una precisión del 93.6% en la predicción de la especie del huésped a partir de las DBS de Cx. quinquefasciatus criadas en laboratorio, superando significativamente la clasificación aleatoria (16.7%). La precisión varió ligeramente según el huésped (89% para perro a 97% para cerdo) y disminuyó modestamente en la marca de 30 horas de digestión (OR = 0.32 para la clasificación correcta en relación con los puntos temporales anteriores).
• Desempeño en Campo: Al aplicarse a muestras de campo con huéspedes conocidos (validados por PCR), el modelo alcanzó una precisión del 67.9%. Este menor desempeño se atribuye a las diferencias entre las condiciones de laboratorio y de campo, incluyendo la ausencia de anticoagulantes en las muestras de campo, la alimentación directa de huéspedes vivos en lugar de membranas, y tiempos de digestión desconocidos.
• Umbral de Probabilidad: La aplicación de un umbral de probabilidad de 0.73 a las muestras de campo mejoró la precisión de la clasificación al 78% para los huéspedes conocidos, aunque esto requirió filtrar el 21% de las muestras (40 muestras).
• Generalizabilidad: El modelo, entrenado con Cx. quinquefasciatus, predijo con éxito las especies de huéspedes para otros géneros (p. ej., Aedes y Armigeres) recolectados en el campo, identificando correctamente 6 de 10 especies no objetivo.
• Comparación con PCR: En el conjunto de datos de campo de Filipinas, el 29.6% de las muestras fallaron en la amplificación mediante PCR, mientras que MIRS-ML proporcionó predicciones para todas las muestras, lo que sugiere una mayor utilidad para muestras degradadas o de digestión avanzada.

Contribuciones Clave

• Primera Aplicación a Culex: Este estudio representa la primera aplicación de MIRS-ML para identificar fuentes de ingesta de sangre en mosquitos Culex, un género de creciente preocupación para las enfermedades transmitidas por vectores.
• Utilidad de las DBS: Demuestra la viabilidad del uso de Manchas de Sangre Seca en papel de filtro como un medio de almacenamiento estable a temperatura ambiente para el análisis MIRS, superando los desafíos de preservación asociados con los mosquitos secos.
• Escalabilidad: El método ofrece una alternativa rápida a la secuenciación; escanear 203 DBS tomó un día laboral, en comparación con los 15 días laborales del flujo de trabajo de secuenciación genética.
• Rentabilidad: El enfoque utiliza un único instrumento (espectrómetro FTIR) sin costos continuos de reactivos, lo que lo hace adecuado para entornos de bajos recursos.

Significancia y Afirmaciones
El artículo afirma que MIRS-ML con DBS es una herramienta práctica y escalable que puede mejorar la comprensión de las interacciones huésped-vector para patógenos como el virus de la encefalitis japonesa. Los autores postulan que, si bien la precisión en campo es actualmente menor que la de laboratorio, la capacidad del método para funcionar sin infraestructura molecular especializada y su éxito con muestras degradadas lo convierten en una valiosa adición a los programas de vigilancia. El estudio sugiere que el desarrollo posterior del modelo, específicamente incorporando muestras recolectadas en campo en los conjuntos de entrenamiento y ampliando el rango de huéspedes identificables, podría mejorar la precisión de la clasificación. Los autores concluyen que este método promete ser una alternativa económica a la PCR para la vigilancia a gran escala de enfermedades transmitidas por vectores, particularmente en regiones donde las dinámicas de transmisión de patógenos están cambiando debido al cambio climático y la globalización.