Surface display of an Anti-CD3 scFv by Saccharomyces boulardii attenuates DSS-induced colitis in mice

Resumo Técnico: Exibição de Superfície de scFv Anti-CD3 por Saccharomyces boulardii para Atenuação de Colite

Definição do Problema
As doenças inflamatórias intestinais (DII), particularmente a colite ulcerativa (CU), são caracterizadas por respostas imunes desequilibradas, ruptura da barreira intestinal e a superativação de células T CD4⁺. Embora anticorpos monoclonais (mAbs) que visam moléculas pró-inflamatórias ou receptores de superfície como o CD3 apresentem potencial terapêutico, sua entrega sistêmica frequentemente enfrenta desafios em relação à biodisponibilidade e ação localizada. Probióticos geneticamente modificados oferecem uma estratégia para a produção e entrega localizada de moléculas terapêuticas dentro do trato gastrointestinal (TGI). No entanto, identificar um vetor microbiano adequado que seja seguro, capaz de expressar proteínas eucarióticas complexas e que consiga exibi-las efetivamente na superfície celular permanece um obstáculo técnico crítico. O Saccharomyces boulardii (Sb), uma levedura probiótica com status GRAS e a capacidade de expressar proteínas recombinantes sem colonização intestinal permanente, é um candidato, mas sua eficácia em exibir fragmentos de anticorpos funcionais para imunoterapia requer validação.

Metodologia
O estudo engenheirou o S. boulardii para funcionar como uma plataforma de entrega oral de um fragmento de cadeia simples (scFv) anti-CD3.

• Construção da Cepa: Duas cepas recombinantes foram criadas usando um vetor de trânsito (derivado de pYC230) contendo o promotor SED1 e o domínio de ancoragem. O scFv (derivado do clone 145-2C11 de camundongo anti-CD3) foi fundido ao âncoras de parede celular SED1. Para otimizar a acessibilidade superficial, dois construtos foram testados, diferindo apenas no comprimento do domínio de haste (extensor):
  • SbAga: Utilizou uma Haste_AGA (289 aminoácidos) baseada em Aga1 de S. cerevisiae.
  • Sb649: Utilizou uma Haste_649 (649 aminoácidos) descrita anteriormente por McMahon et al.
  • Ambos os construtos incluíram tags HA na extremidade N-terminal e FLAG na extremidade C-terminal, separadas por um espaçador GSGS.
• Caracterização In Vitro: A expressão de superfície foi monitorada via citometria de fluxo ao longo de 48 horas utilizando anticorpos anti-FLAG.
• Modelo In Vivo: Um modelo de colite induzida por Dextrano Sulfato de Sódio (DSS) em camundongos C57BL/6 foi estabelecido. Os camundongos receberam gavagem oral diária de Sb selvagem (SbWT), da cepa Sb649 engenheirada, ou salina três dias antes da indução de DSS.
• Métricas de Avaliação: A gravidade da doença foi avaliada pelo Índice de Atividade da Doença (DAI), que incorpora perda de peso, consistência das fezes e sangramento retal. As razões de peso do cólon para o comprimento foram medidas. A análise de expressão gênica (qPCR) foi realizada nos linfonodos mesentéricos (LMs) e no tecido colônico para avaliar a modulação imune (ex: Foxp3, Il6, Tbx21) e a integridade da barreira (Muc3, Tjp1).

Principais Contribuições

1. Otimização da Exibição de Superfície: O estudo demonstrou que o comprimento do linker/haste impacta significativamente a estabilidade da exibição do fragmento de anticorpo em S. boulardii. A haste mais longa (Sb649) manteve a expressão de superfície estável ao longo do tempo, enquanto a haste mais curta (SbAga) apresentou um declínio acentuado após 40 horas.
2. Prova de Conceito para Imunoterapia Oral: A pesquisa estabeleceu que o S. boulardii pode exibir com sucesso um scFv anti-CD3 funcional em sua superfície e entregá-lo ao ambiente intestinal em um hospedeiro vivo.
3. Eficácia Terapêutica: A cepa Sb649 engenheirada mostrou-se capaz de atenuar a colite induzida por DSS de forma mais eficaz do que a cepa selvagem, vinculando a exibição de superfície do anti-CD3 à redução da atividade da doença.

Resultados

• Estabilidade de Expressão: A citometria de fluxo revelou que o Sb649 manteve uma proporção maior e mais estável de células positivas para o anticorpo durante o cultivo em comparação ao SbAga, que atingiu o pico em 40 horas e declinou rapidamente. Consequentemente, o Sb649 foi selecionado para testes in vivo.
• Atenuação da Doença: No modelo de DSS, o tratamento com Sb649 reduziu significativamente a Área Sob a Curva (AUC) do Índice de Atividade da Doença (DAI) em comparação aos grupos DSS-apenas e DSS+SbWT. Camundongos tratados com Sb649 exibiram redução na perda de peso e mantiveram valores de DAI mais próximos dos controles saudáveis durante seis dias de indução de inflamação. Embora o encurtamento do cólon tenha ocorrido em todos os grupos DSS, o tratamento com Sb649 mitigou especificamente a perda de peso.
• Imunomodulação:
  • Linfonodos Mesentéricos (LMs): O tratamento com Sb649 resultou em uma regulação positiva de Il6 menos pronunciada em comparação aos grupos DSS e DSS+SbWT, sugerindo uma modulação da produção de citocinas pró-inflamatórias. A expressão de Foxp3 foi elevada em todos os grupos doentes, mas foi maior no grupo Sb649, indicando um potencial desvio para um fenótipo de célula T reguladora.
  • Tecido Colônico: A expressão de Muc3 (um gene de mucina) foi significativamente maior no grupo Sb649 em comparação aos grupos DSS e DSS+SbWT, sugerindo um aumento da proteção mucosa. Não foram observadas diferenças significativas na expressão de Il10 ou Tjp1 (proteína de junção estreita), embora os grupos tratados com Sb tenham mostrado níveis comparáveis aos controles saudáveis.

Significância e Alegações
O artigo alega que o S. boulardii é uma plataforma viável para a produção e exibição de superfície de fragmentos de anticorpos para imunoterapia gastrointestinal. O estudo conclui que o Sb649 engenheirado exibe o scFv anti-CD3 de forma estável em sua superfície e exerce efeitos protetores e imunomoduladores em um modelo murino de colite. Os autores postulam que os benefícios observados decorrem provavelmente da indução de ativação parcial de células T e tolerância pelo scFv anti-CD3 exibido, suprimindo assim a inflamação excessiva.

Os autores mantêm um tom modesto quanto ao mecanismo, reconhecendo que a proporção de levedura expressando o scFv foi limitada e que a quantidade exata de anticorpo biologicamente ativo que chega ao cólon permanece incerta. Eles observam que o delineamento experimental (indução aguda de DSS sem uma fase de remissão) pode ter subestimado os efeitos combinados do probiótico e do anticorpo recombinante. O estudo sugere que, embora os resultados apoiem o potencial deste sistema de entrega microbiana, otimizações adicionais e investigações sobre o ambiente inflamatório são necessárias para esclarecer totalmente sua eficácia terapêutica.