Surface display of an Anti-CD3 scFv by Saccharomyces boulardii attenuates DSS-induced colitis in mice

*技術要約：Saccharomyces boulardiiによる抗CD3 scFvの表面提示を用いた大腸炎の軽減*

問題提起
炎症性腸疾患（IBD）、特に潰瘍性大腸炎（UC）は、免疫応答の不均衡、腸管バリアの破壊、およびCD4⁺ T細胞の過剰活性化を特徴とする。CD3やその他の表面受容体などのプロ炎症性分子を標的とするモノクローナル抗体（mAb）は治療の可能性を示しているが、その全身投与は、バイオアベイラビリティや局所的な作用に関して課題に直面することが多い。遺伝子組み換えプロバイオティクスは、胃腸管（GIT）内での治療分子の局所的な生産とデリバリーのための戦略を提供する。しかし、安全であり、複雑な真核生物タンパク質を発現でき、かつそれらを細胞表面に効果的に提示できる適切な微生物ベクターを特定することは、依然として重要な技術的障壁である。Saccharomyces boulardii（Sb）は、GRASステータスを持ち、恒久的な腸内定着なしに組換えタンパク質を発現できるプロバイオティック酵母であり、候補となる。しかし、免疫療法のために機能的な抗体断片を表面に提示する際のその有効性は、検証を必要とする。

方法論
本研究では、抗CD3単鎖可変領域断片（scFv）の経口デリバリープラットフォームとして機能するようにS. boulardiiを設計した。

• 菌株構築: シャトルベクター（SED1プロモーターおよびアンカリングドメインを含むpYC230派生体）を用いて、2つの組換え菌株を作成した。scFv（マウス抗CD3クローン145-2C11由来）は、SED1細胞壁アンカーに融合させた。表面へのアクセシビリティを最適化するため、ストーク（エクステンダー）ドメインの長さのみが異なる2つの構築物をテストした：
  • SbAga: S. cerevisiaeのAga1に基づくAGA_Stalk（289アミノ酸）を利用。
  • Sb649: McMahonらによって以前に記述された649_Stalk（649アミノ酸）を利用。
  • 両方の構築物には、GSGSスペーサーで分離されたN末端HAおよびC末端FLAGタグが含まれている。
• in vitro 特性評価: 抗FLAG抗体を用いたフローサイトメトリーにより、48時間にわたる表面発現をモニタリングした。
• in vivo モデル: C57BL/6マウスを用いて、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発性大腸炎モデルを確立した。マウスに対し、DSS誘導の3日前から、野生型Sb（SbWT）、設計されたSb649株、または生理食塩水のいずれかを毎日経口投与した。
• 評価指標: 疾患の重症度は、体重減少、便の性状、および直腸出血を組み込んだ疾患活動性指数（DAI）によって評価した。結腸の重量対長さ比を測定した。免疫調節（例：Foxp3、Il6、Tbx21）およびバリア完全性（Muc3、Tjp1）を評価するために、腸間膜リンパ節（MLN）および結腸組織に対して遺伝子発現解析（qPCR）を実施した。

主要な貢献

1. 表面提示の最適化: 本研究は、リンカー／ストークの長さがS. boulardiiにおける抗体断片提示の安定性に大きく影響することを実証した。長いストーク（Sb649）は、時間の経過とともに安定した表面発現を維持したが、短いストーク（SbAga）は40時間後に急激な低下を示した。
2. 経口免疫療法の概念実証: 本研究は、S. boulardiiが機能的な抗CD3 scFvをその表面に提示し、生体内ホストの腸内環境へデリバリーできることを確立した。
3. 治療有効性: 設計されたSb649株は、野生型株よりもDSS誘発性大腸炎をより効果的に減衰させることが示され、表面提示された抗CD3と疾患活動性の減少が関連付けられた。

結果

• 発現安定性: フローサイトメトリーにより、Sb649は培養中を通じて、抗体陽性細胞の高い割合と安定性を維持したのに対し、SbAgaは40時間でピークに達した後、急速に減少したことが明らかになった。したがって、in vivo試験にはSb649が選択された。
• 疾患減衰: DSSモデルにおいて、Sb649処理は、DSS単独群およびDSS+SbWT群と比較して、疾患活動性指数（DAI）の曲線下面積（AUC）を有意に減少させた。Sb649処理されたマウスは、体重減少が抑制され、6日間の炎症誘導期間を通じてDAI値が健康なコントロールに近い状態を維持した。すべてのDSS群で結腸の短縮が見られたが、Sb649処理は特に体重減少を軽減した。
• 免疫調節:
  • MLN: Sb649処理は、DSSおよびDSS+SbWT群と比較してIl6の上昇がより緩やかであり、プロ炎症性サイトカイン産生の調節を示唆した。Foxp3の発現はすべての疾患群で上昇したが、Sb649群で最も高く、制御性T細胞表現型への潜在的なシフトを示した。
  • 結腸組織: Muc3（ムチン遺伝子）の発現は、DSSおよびDSS+SbWT群と比較してSb649群で有意に高く、粘膜保護の強化を示唆した。Il10またはTjp1（タイトジャンクションタンパク質）の発現に有意な差は見られなかったが、Sb処理群は健康なコントロールと同等のレベルを示した。

意義と主張
本論文は、S. boulardiiが胃腸免疫療法のための抗体断片の生産および表面提示のための実行可能なプラットフォームであることを主張している。本研究は、設計されたSb649株が抗CD3 scFvを安定して表面に提示し、マウスの大腸炎モデルにおいて保護的および免疫調節的な効果を発揮することを結論づけている。著者らは、観察された利益は、提示された抗CD3 scFvが部分的なT細胞の活性化と寛容を誘導し、それによって過剰な炎症を抑制することによるものであると仮定している。

著者らはメカニズムに関して控えめなトーンを維持しており、scFvを発現している酵母の割合が限定的であること、および生物学的に活性な抗体が実際に大腸に到達する正確な量は不明であることを認めている。また、実験デザイン（寛解期のない急性DSS誘導）が、プロバイオティクスと組換え抗体の相乗効果を過小評価した可能性があるとも述べている。本研究は、これらの結果がこの微生物デリバリーシステムの可能性を支持しているものの、治療的有効性を完全に解明するためには、さらなる最適化と炎症環境の調査が必要であることを示唆している。