Surface display of an Anti-CD3 scFv by Saccharomyces boulardii attenuates DSS-induced colitis in mice

Resumen Técnico: Expresión Superficial de anti-CD3 scFv por Saccharomyces boulardii para la Atenuación de la Colitis

Planteamiento del Problema
Las enfermedades inflamatorias intestinales (EII), particularmente la colitis ulcerosa (CU), se caracterizan por una respuesta inmunitaria desequilibrada, la ruptura de la barrera intestinal y la sobreactivación de las células T CD4⁺. Aunque los anticuerpos monoclonales (mAbs) dirigidos contra moléculas proinflamatorias o receptores de superficie como el CD3 muestran un potencial terapéutico, su administración sistémica suele enfrentar desafíos relacionados con la biodisponibilidad y la acción localizada. Los probióticos modificados genéticamente ofrecen una estrategia para la producción y entrega localizada de moléculas terapéuticas dentro del tracto gastrointestinal (TGI). Sin embargo, identificar un vector microbiano adecuado que sea seguro, capaz de expresar proteínas eucariotas complejas y que pueda exhibirlas eficazmente en su superficie celular sigue siendo un obstáculo técnico crítico. Saccharomyces boulardii (Sb), una levadura probiótica con estatus GRAS y la capacidad de expresar proteínas recombinantes sin colonización intestinal permanente, es un candidato, pero su eficacia para exhibir fragmentos de anticuerpos funcionales para la inmunoterapia requiere validación.

Metodología
El estudio diseñó mediante ingeniería a S. boulardii para funcionar como una plataforma de administración oral de un fragmento de cadena sencilla (scFv) anti-CD3.

• Construcción de la Cepa: Se crearon dos cepas recombinantes utilizando un vector de lanzadera (derivado de pYC230) que contiene el promotor SED1 y el dominio de anclaje. El scFv (derivado del clon 145-2C11 de ratón anti-CD3) se fusionó al ancla de la pared celular SED1. Para optimizar la accesibilidad superficial, se probaron dos constructos que diferían únicamente en la longitud del dominio del tallo (extensor):
  • SbAga: Utilizó un AGA_Stalk (tallo AGA, 289 aminoácidos) basado en S. cerevisiae Aga1.
  • Sb649: Utilizó un 649_Stalk (tallo 649, 649 aminoácidos) descrito previamente por McMahon et al.
  • Ambos constructos incluyeron etiquetas N-terminales HA y C-terminales FLAG para su detección, separadas por un espaciador GSGS.
• Caracterización In Vitro: La expresión superficial se monitoreó mediante citometría de flujo durante 48 horas utilizando anticuerpos anti-FLAG.
• Modelo In Vivo: Se estableció un modelo de colitis inducida por dextrano sulfato de sodio (DSS) en ratones C57BL/6. Los ratones recibieron administración oral diaria de Sb silvestre (SbWT), la cepa Sb649 modificada por ingeniería, o solución salina tres días antes de la inducción de DSS.
• Métricas de Evaluación: La gravedad de la enfermedad se evaluó mediante el Índice de Actividad de la Enfermedad (DAI), que incorpora la pérdida de peso, la consistencia de las heces y el sangrado rectal. Se midieron las relaciones peso del colon/longitud del colon. El análisis de expresión génica mediante qPCR se realizó en los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN) y en el tejido colónico para evaluar la modulación inmunitaria (p. ej., Foxp3, Il6, Tbx21) y la integridad de la barrera (Muc3, Tjp1).

Contribuciones Clave

1. Optimización de la Exposición Superficial: El estudio demostró que la longitud del conector/tallo impacta significativamente la estabilidad de la exhibición del fragmento de anticuerpo en S. boulardii. El tallo más largo (Sb649) mantuvo una expresión superficial estable a lo largo del tiempo, mientras que el tallo más corto (SbAga) mostró un descenso pronunciado después de 40 horas.
2. Prueba de Concepto para la Inmunoterapia Oral: La investigación estableció que S. boulardii puede exhibir con éxito un scFv anti-CD3 funcional en su superficie y entregarlo al entorno intestinal en un huésped vivo.
3. Eficacia Terapéutica: Se demostró que la cepa Sb649 modificada atenúa la colitis inducida por DSS de manera más efectiva que la cepa silvestre, vinculando la exhibición superficial de anti-CD3 con la reducción de la actividad de la enfermedad.

Resultados

• Estabilidad de la Expresión: La citometría de flujo reveló que la Sb649 mantuvo una proporción más alta y estable de células positivas para el anticuerpo durante el cultivo en comparación con la SbAga, la cual alcanzó su pico a las 40 horas y declinó rápidamente. En consecuencia, la Sb649 fue seleccionada para las pruebas in vivo.
• Atenuación de la Enfermedad: En el modelo de DSS, el tratamiento con Sb649 redujo significativamente el Área Bajo la Curva (AUC) del Índice de Actividad de la Enfermedad (DAI) en comparación con los grupos de DSS solo y DSS+SbWT. Los ratones tratados con Sb649 mostraron una reducción en la pérdida de peso y mantuvieron los valores de DAI más cercanos a los controles sanos durante seis días de inducción de la inflamación. Aunque ocurrió un acortamiento del colon en todos los grupos de DSS, el tratamiento con Sb649 mitigó específicamente la pérdida de peso.
• Inmunomodulación:
  • MLN: El tratamiento con Sb649 resultó en una regulación al alza de Il6 menos pronunciada en comparación con los grupos de DSS y DSS+SbWT, lo que sugiere una modulación de la producción de citocinas proinflamatorias. La expresión de Foxp3 se elevó en todos los grupos enfermos, pero fue mayor en el grupo Sb649, indicando un potencial cambio hacia un fenotipo de células T reguladoras.
  • Tejido Colónico: La expresión de Muc3 (un gen de mucina) fue significativamente mayor en el grupo Sb649 en comparación con los grupos de DSS y DSS+SbWT, lo que sugiere una mejora en la protección de la mucosa. No se observaron diferencias significativas en la expresión de Il10 o Tjp1 (proteína de unión estrecha), aunque los grupos tratados con Sb mostraron niveles comparables a los controles sanos.

Significancia y Reivindicaciones
El artículo afirma que S. boulardii es una plataforma viable para la producción y exhibición superficial de fragmentos de anticuerpos para la inmunoterapia gastrointestinal. El estudio concluye que la cepa Sb649 modificada exhibe de manera estable el scFv anti-CD3 y ejerce efectos protectores e inmunomoduladores en un modelo de colitis murino. Los autores postulan que los beneficios observados se deben probablemente a que el scFv anti-CD3 exhibido induce una activación parcial de las células T y tolerancia, suprimiendo así la inflamación excesiva.

Los autores mantienen un tono modesto respecto al mecanismo, reconociendo que la proporción de levadura que expresa el scFv fue limitada y que la cantidad exacta de anticuerpo biológicamente activo que llega al colon sigue siendo incierta. Señalan que el diseño experimental (inducción aguda de DSS sin una fase de remisión) puede haber subestimado los efectos combinados del probiótico y el anticuerpo recombinante. El estudio sugiere que, si bien los resultados respaldan el potencial de este sistema de entrega microbiana, es necesaria una mayor optimización e investigación sobre el entorno inflamatorio para esclarecer plenamente su eficacia terapéutica.