P2-seq resolves topology-dependent DNA structural states and their long-range coupling in individual molecules
本文介绍了高锰酸盐孔道测序技术（Permanganate Pore-Seq, P2-seq），这是一种单分子测序方法，通过在近核苷酸分辨率下绘制超螺旋依赖的构象状态图谱，为远距离非B DNA结构之间的长程扭转耦合与竞争提供了直接证据。
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在每一个活细胞内，遗传密码并非松散、笔直的线条，而是一个紧密缠绕、扭曲的梯子。这种被称为“超螺旋”的扭转是DNA的一种基本物理特性，是在细胞机器读取和复制遗传指令时自然产生的。当读取DNA的分子马达沿着链条移动时，它们会在身后扭转螺旋，产生类似于被拧得太紧的橡皮筋所产生的张力。这种张力不仅仅是一种被动的副产物；它是一种强大的力量，可以重塑DNA分子本身。在适当的条件下，这种压力会导致双螺旋解开、翻转或折叠成复杂的非标准形状。这些替代结构被认为起到了开关的作用，控制着基因的开启或关闭。然而，几十年来，科学家们一直难以看清这些形状究竟是如何形成的，它们是如何相互作用的，以及物理压力是如何在单个DNA分子上分配的。
美国国家卫生研究院的一个研究小组现在开发出一种新方法，能够以空前的清晰度观察单个DNA分子上发生的这些事件。他们创造了一种名为P2-seq的技术，该技术结合了一种能突出显示DNA开放或不稳定部分的化学染色剂，以及一种能够一次性读取长链遗传密码的强大测序技术。通过使用一种仅标记那些暂时从伙伴处分离出来的碱基的化学物质处理DNA，然后读取整个分子，研究人员可以精确地绘制出DNA在哪里发生了扭转、熔解或折叠。这种方法使他们不仅能看到一群DNA分子的平均行为，还能看到每条独立链条的独特故事，揭示了同一分子的不同远端部分是如何进行通信并为可用的物理应力进行竞争的。
研究人员首先通过取圆形DNA质粒并仔细调节其扭转程度，创造出一系列从松弛到紧密扭转的分子。随后，他们应用了一种化学处理方法，该方法专门与暴露出的胸腺嘧啶碱基发生反应，而当DNA链打开或形成非标准形状时，就会发生这种情况。利用纳米孔测序技术，他们将这些经过处理的分子通过微小的孔径，测量其通过时的电流。由于化学标记改变了电流的方式，团队可以精准定位哪些碱基被修改了。为了处理海量的原始数据，他们开发了一种新的计算工具，将处理过的DNA信号与未经处理的对照组进行比较，从而能够在无需合成人工参考样本的情况下检测出这些细微变化。
从这种高分辨率的视角中呈现出来的是一个动态的结构变化图景。团队发现，随着DNA变得更加扭曲，特定区域会解开或折叠成如十字形（cruciforms）之类的形状。至关重要的是，他们观察到这些结构变化并非随机或独立的事件。相反，研究人员发现了同一分子内不同远端部分之间存在直接的竞争。当一段DNA通过形成稳定结构来吸收扭转应力时，它会减少其他部分改变形状所需的应力。例如，如果远离折叠位点的特定区域开始熔解和解开，它就会阻止附近的一个十字形结构形成。这提供了第一个关于同一拓扑结构域内的不同DNA元件是如何通过逆向耦合、争夺共享物理能量的直接的单分子证据。
研究还表明，DNA并不总是通过形成大型、明显的结构来缓解压力。在许多情况下，研究人员检测到一种更微妙、分布式的压力形式，即双螺旋在整个长度上变得略微不稳定，而不仅仅是在特定的热点区域。这种“骨架”反应性随着整体扭转度的增加而增加，但当十字形等稳定结构形成时，它又会减少，这表明分子有两种处理张力的方式：要么通过创建几个强烈的局部形状，要么通过将不稳定性扩散到广泛的区域。研究人员能够追踪随着他们向DNA添加仅仅一个额外的扭转，这种平衡在两种模式之间是如何转变的，展示了分子如何以非线性的、高度特异性的方式重新分配其应力。
通过观察单个分子，团队还捕捉到了在体量测量中通常会被掩盖的罕见且稍纵即逝的中间体。他们识别出了十字形结构折叠过程中的特定步骤，看到了分子在完全挤出之前形成发夹环（hairpin loop）的过程。他们发现，分子进行折叠的路径取决于化学环境，不同的盐浓度会促成不同的折叠路径。这种细节水平使他们能够重建折叠路径，并看到多个结构状态可以根据精确的扭转量和局部序列在同一分子上并存。
研究结果表明，DNA拓扑结构充当了调节信息的载体，在基因结构域内传递物理信号。在单分子水平上观察这些相互作用的能力改变了科学家对基因组力学的理解。它表明，DNA的物理状态不是静态的背景，而是一个动态的、竞争性的系统，其中远端的元素直接相互影响。这种新方法P2-seq提供了一种以近乎核苷酸精度的精度来绘制这些结构状态及其耦合的方法，为研究DNA物理形状如何影响其功能提供了框架。虽然实验是在试管中的圆形DNA上进行的，但关于应力如何分配和共享的原理预计将适用于活细胞内复杂的线性DNA，从而为理解物理力量如何驱动生物过程打开了大门。
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