P2-seq resolves topology-dependent DNA structural states and their long-range coupling in individual molecules

In jeder lebenden Zelle ist der genetische Code kein lockerer, gerader Strang, sondern eine eng gewundene, verdrehte Leiter. Diese Verdrehung, bekannt als Supercoiling, ist eine fundamentale physikalische Eigenschaft der DNA, die natürlich entsteht, wenn die Maschinerie der Zelle die genetischen Anweisungen liest und kopiert. Wenn die molekularen Motoren, die die DNA lesen, sich entlang des Strangs bewegen, verdrehen sie die Helix hinter sich und erzeugen dabei eine Spannung, die ganz ähnlich wie ein zu fest aufgewickeltes Gummiband wirkt. Diese Spannung ist nicht nur ein passives Nebenprodukt; sie ist eine kraftvolle Kraft, die das DNA-Molekül selbst umgestalten kann. Unter den richtigen Bedingungen kann dieser Stress dazu führen, dass sich die Doppelhelix entwindet, nach innen umstülpt oder sich in komplexe, nicht-standardmäßige Formen faltet. Es wird angenommen, dass diese alternativen Strukturen als Schalter fungieren, die Gene an- oder ausschalten, doch über Jahrzehnte hinweg haben Wissenschaftler Schwierigkeiten gehabt, genau zu sehen, wie diese Formen entstehen, wie sie miteinander interagieren und wie die physikalische Spannung auf ein einzelnes DNA-Molekül verteilt wird.

Ein Team von Forschern an den National Institutes of Health hat nun eine neue Methode entwickelt, um diese Ereignisse an einzelnen DNA-Molekülen mit beispielloser Klarheit zu beobachten. Sie entwickelten eine Technik namens P2-seq, die einen chemischen Farbstoff kombiniert, der offene oder instabile Teile der DNA hervorhebt, mit einer leistungsstarken Sequenzierungstechnologie, die lange Stränge des genetischen Codes in einem Durchgang liest. Indem sie die DNA mit einer Chemikalie behandelten, die nur jene Basen markiert, die sich vorübergehend von ihren Partnern getrennt haben, und dann das gesamte Molekül auslasen, konnten die Forscher exakt kartieren, wo die DNA verdreht, geschmolzen oder gefaltet war. Dieser Ansatz ermöglichte es ihnen, nicht nur das durchschnittliche Verhalten einer Menge von DNA-Molekülen zu sehen, sondern die einzigartige Geschichte jedes einzelnen Strangs zu enthüllen und zu zeigen, wie ferne Teile desselben Moleküls miteinander kommunizieren und um die verfügbare physikalische Spannung konkurrieren.

Die Forscher begannen damit, kreisförmige DNA-Plasmide zu nehmen und deren Verdrehungsgrad sorgfältig anzupassen, wobei sie eine Bandbreite von Molekülen von entspannt bis eng gewunden erzeugten. Dann wandten sie eine chemische Behandlung an, die spezifisch mit Thymin-Basen reagiert, wenn diese exponiert sind – was geschieht, wenn sich der DNA-Strand öffnet oder eine nicht-standardmäßige Form bildet. Mit einem Nanoporen-Sequenziergerät ließen sie diese behandelten Moleküle durch winzige Poren gleiten und maßen den elektrischen Strom, während sie hindurchglitten. Da die chemische Markierung den Strom auf eine unterscheidbare Weise veränderte, konnte das Team genau bestimmen, welche Basen modifiziert worden waren. Um die gewaltige Menge an Rohdaten zu bewältigen, entwickelten sie ein neues computergestütztes Werkzeug, das die Signale der behandelten DNA mit unbehandelten Kontrollen verglich, was es ihnen ermöglichte, diese subtilen Veränderungen zu detektieren, ohne künstliche Referenzproben synthetisieren zu müssen.

Was sich aus dieser hochauflösenden Ansicht ergab, war eine dynamische Landschaft struktureller Veränderungen. Das Team fand heraus, dass sich spezifische Regionen beim Zunahme der Verdrehung der DNA entwinden oder in Formen wie Kreuzformen (Cruciformen) falten. Entscheidend war, dass sie beobachteten, dass diese strukturellen Veränderungen keine zufälligen oder unabhängigen Ereignisse waren. Stattdessen entdeckten die Forscher eine direkte Konkurrenz zwischen fernen Teilen desselben Moleküls. Wenn ein bestimmter Abschnitt der DNA die Verdrehungsspannung absorbierte, indem er eine stabile Struktur bildete, reduzierte dies die Menge an Spannung, die für andere Abschnitte zur Formveränderung zur Verfügung stand. Wenn zum Beispiel ein weit entfernter Bereich vom Faltungssitz zu schmelzen und sich zu entwinden begann, verhinderte dies die Bildung einer nahegelegenen Kreuzform. Dies lieferte den ersten direkten Beleg auf Einzelmolekül-Ebene dafür, dass verschiedene DNA-Elemente innerhalb desselben topologischen Domänenbereich gekoppelt sind und sich gegenseitig negativ beeinflussen, indem sie um einen gemeinsamen Pool an physikalischer Energie kämpfen.

Die Studie zeigte auch, dass die DNA den Stress nicht immer durch die Bildung großer, distinkter Strukturen abbaut. In vielen Fällen detektierten die Forscher eine subtilere, verteilte Form des Stresses, bei der die Doppelhelix über ihre gesamte Länge leicht instabil wurde, anstatt nur an spezifischen Hotspots. Diese „Backbone“-Reaktivität nahm mit zunehmender Gesamtwendung zu, verringerte sich jedoch, wenn stabile Strukturen wie Kreuzformen entstanden, was darauf hindeutet, dass das Molekül zwei Wege hat, Spannung zu bewältigen: entweder durch das Erzeugen einiger weniger, starker, lokalisierter Formen oder durch das Verteilen der Instabilität über einen weiten Bereich. Die Forscher waren in der Lage zu verfolgen, wie sich das Gleichgewicht zwischen diesen beiden Modi verschob, wenn sie nur eine einzige zusätzliche Drehung zur DNA hinzufügten, was zeigte, dass das Molekül seinen Stress auf eine nicht-lineare, hochspezifische Weise umverteilt.

Durch die Betrachtung einzelner Moleküle konnte das Team auch seltene, flüchtige Zwischenzustände erfassen, die in Massenmessungen normalerweise verborgen bleiben. Sie identifizierten spezifische Schritte im Faltungsprozess von Kreuzformen und sahen Moleküle, die gerade dabei warenCaught, eine Haarnadelstruktur (Hairpin-Loop) zu bilden, bevor diese vollständig ausgestülpt war. Sie fanden heraus, dass der Pfad, den ein Molekül bei der Faltung nimmt, von der chemischen Umgebung abhängt, wobei unterschiedliche Salzkonzentrationen verschiedene Faltungswege begünstigen. Diese Detailtiefe ermöglichte es ihnen, die Faltungspfade zu rekonstruieren und zu sehen, dass mehrere strukturelle Zustände auf demselben Molekül koexistieren können, abhängig von der präzisen Menge an Verdrehung und der lokalen Sequenz.

Die Ergebnisse legen nahe, dass die DNA-Topologie als Träger regulatorischer Informationen fungiert, der physikalische Signale über lange Distanzen innerhalb einer Gendomäne überträgt. Die Fähigkeit, diese Interaktionen auf Einzelmolekül-Ebene zu beobachten, verändert grundlegend, wie Wissenschaftler die Mechanik des Genoms verstehen. Es zeigt, dass der physikalische Zustand der DNA nicht ein statischer Hintergrund ist, sondern ein dynamisches, kompetitives System, in dem ferne Elemente sich direkt gegenseitig beeinflussen. Die neue Methode, P2-seq, bietet eine Möglichkeit, diese strukturellen Zustände und deren Kopplung mit Präzision bis auf die Nähe eines Nukleotids zu kartieren, und liefert einen Rahmen, um zu untersuchen, wie die physikalische Form der DNA ihre Funktion in Gesundheit und Krankheit beeinflusst. Obwohl die Experimente an kreisförmiger DNA in einem Reagenzglas durchgeführt wurden, wird erwartet, dass die Prinzipien, wie Stress aufgeteilt und geteilt wird, auch auf die komplexe, lineare DNA in lebenden Zellen anwendbar sind, was die Tür zum Verständnis darüber öffnet, wie die physikalischen Kräfte des Genoms biologische Prozesse steuern.