P2-seq resolves topology-dependent DNA structural states and their long-range coupling in individual molecules
Questo articolo introduce la Permanganate Pore-Seq (P2-seq), un metodo di sequenziamento a singola molecola che fornisce una prova diretta dell'accoppiamento torsionale a lungo raggio e della competizione tra strutture di DNA non-B distanti, mappando gli stati conformazionali dipendenti dal superavvolgimento a una risoluzione quasi nucleotidica.
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All'interno di ogni cellula vivente, il codice genetico non è una corda sciolta e dritta, ma una scala a pioli strettamente avvolta e ritorta. Questa torsione, nota come superavvolgimento, è una proprietà fisica fondamentale del DNA che sorge naturalmente mentre i macchinari cellulari leggono e copiano le istruzioni genetiche. Quando i motori molecolari che leggono il DNA si muovono lungo il filamento, torcono l'elica dietro di sé, creando tensione proprio come un elastico che è stato avvolto troppo stretto. Questa tensione non è solo un sottoprodotto passivo; è una forza potente che può rimodellare la molecola di DNA stessa. Sotto le giuste condizioni, questo stress può far srotolare la doppia elica, farla ribaltare o piegare in forme complesse e non standard. Si ritiene che queste strutture alternative agiscano come interruttori, accendendo o spegnendo i geni, eppure per decenni gli scienziati hanno faticato a vedere esattamente come queste forme si formino, come interagiscano tra loro e come lo stress fisico venga condiviso attraverso una singola molecola di DNA.
Un team di ricercatori presso i National Institutes of Health ha ora sviluppato un nuovo metodo per osservare questi eventi mentre si svolgono su singole molecole di DNA con una chiarezza senza precedenti. Hanno creato una tecnica chiamata P2-seq, che combina una colorazione chimica che evidenzia le parti aperte o instabili del DNA con una potente tecnologia di sequenziamento che legge lunghi filamenti di codice genetico in un colpo solo. Trattando il DNA con una sostanza chimica che marca solo le basi che si sono temporaneamente separate dai loro partner, e poi leggendo l'intera molecola, i ricercatori sono stati in grado di mappare esattamente dove il DNA fosse ritorto, fuso o ripiegato. Questo approccio ha permesso loro di vedere non solo il comportamento medio di una folla di molecole di DNA, ma la storia unica di ogni singolo filamento, rivelando come parti distanti della stessa molecola comunichino e competano per la tensione fisica disponibile.
I ricercatori hanno iniziato prendendo plasmidi di DNA circolare e regolando con cura il loro livello di torsione, creando una gamma di molecole che andavano da rilassate a strettamente avvolte. Hanno poi applicato un trattamento chimico che reagisce specificamente con le basi di timina quando queste sono esposte, il che accade quando il filamento di DNA si apre o forma una forma non standard. Utilizzando un sequenziatore a nanoporo, hanno fatto passare queste molecole trattate attraverso minuscoli pori, misurando la corrente elettrica durante il passaggio. Poiché il marchio chimico alterava la corrente in un modo distinto, il team è riuscito a individuare esattamente quali basi fossero state modificate. Per dare senso alla massiccia quantità di dati grezzi, hanno sviluppato un nuovo strumento computazionale che confrontava i segnali del DNA trattato con i controlli non trattati, permettendo loro di rilevare questi cambiamenti sottili senza la necessità di sintetizzare campioni di riferimento artificiali.
Ciò che è emerso da questa visione ad alta risoluzione è stato un panorama dinamico di cambiamenti strutturali. Il team ha scoperto che man mano che il DNA veniva più ritorto, regioni specifiche si srotolavano o si ripiegavano in forme come i cruciformi, che appaiono come croci. Fondamentalmente, hanno osservato che questi cambiamenti strutturali non erano eventi casuali o indipendenti. Inveve, i ricercatori hanno scoperto una diretta competizione tra parti distanti della stessa molecola. Quando una sezione del DNA assorbiva lo stress di torsione formando una struttura stabile, riduceva la quantità di stress disponibile affinché altre sezioni cambiassero forma. Ad esempio, se una regione specifica lontana da un sito di ripiegamento iniziava a fondersi e srotolarsi, impediva la formazione di una struttura cruciforme nelle vicinanze. Ciò ha fornito la prima prova diretta, su singola molecola, che diversi elementi del DNA all'interno dello stesso dominio topologico siano accoppiati inversamente, lottando per un pool condiviso di energia fisica.
Lo studio ha anche rivelato che il DNA non sempre allevia lo stress formando strutture grandi e distinte. In molti casi, i ricercatori hanno rilevato una forma di stress più sottile e distribuita, in cui la doppia elica diventava leggermente instabile lungo tutta la sua lunghezza, piuttosto che solo in hotspot specifici. Questa reattività della "colonna vertebrale" aumentava all'aumentare della torsione complessiva, ma diminuiva quando si formavano strutture stabili come i cruciformi, suggerendo che la molecola abbia due modi per gestire la tensione: o creando poche forme localizzate e forti, o distribuendo l'instabilità su un'area ampia. I ricercatori sono stati in grado di tracciare come l'equilibrio tra questi due modi cambiasse aggiungendo anche un solo giro extra di torsione al DNA, mostrando che la molecola ridistribuisce il suo stress in modo non lineare e altamente specifico.
Osservando le singole molecole, il team è stato anche in grado di catturare intermedi rari e fugaci che sono solitamente nascosti nelle misurazioni di massa. Hanno identificato passaggi specifici nel processo di ripiegamento delle strutture cruciformi, vedendo molecole colte nell'atto di formare un loop a forcina prima che venisse completamente estruso. Hanno scoperto che il percorso che una molecola compie per ripiegarsi dipende dall'ambiente chimico, con diverse condizioni saline che favoriscono percorsi di ripiegamento differenti. Questo livello di dettaglio ha permesso loro di ricostruire i percorsi di ripiegamento e vedere che molteplici stati strutturali possono coesistere sulla stessa molecola, a seconda dell'esatta quantità di torsione e della sequenza locale.
Le scoperte suggeriscono che la topologia del DNA agisca come un portatore di informazioni regolatorie, trasmettendo segnali fisici attraverso lunghe distanze all'interno di un dominio genico. La capacità di osservare queste interazioni a livello di singola molecola cambia il modo in cui gli scienziati comprendono la meccanica del genoma. Dimostra che lo stato fisico del DNA non è uno sfondo statico, ma un sistema dinamico e competitivo in cui elementi distanti si influenzano direttamente. Il nuovo metodo, P2-seq, offre un modo per mappare questi stati strutturali e il loro accoppiamento con una precisione vicina al singolo nucleotide, fornendo un quadro per studiare come la forma fisica del DNA influenzi la sua funzione nella salute e nella malattia. Sebbene gli esperimenti siano stati condotti su DNA circolare in una provetta, i principi di come lo stress viene ripartito e condiviso si prevede si applichino al complesso DNA lineare presente nelle cellule viventi, aprendo la porta alla comprensione di come le forze fisiche del genoma guidino i processi biologici.
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