P2-seq resolves topology-dependent DNA structural states and their long-range coupling in individual molecules

Binnen elke levende cel is de genetische code geen losse, rechte draad, maar een strak gewikkelde, gedraaide ladder. Dit draaien, bekend als supercoiling, is een fundamentele fysieke eigenschap van DNA die van nature ontstaat wanneer de machinerie van de cel de genetische instructies leest en kopieert. Wanneer de moleculaire motoren die het DNA lezen langs de streng bewegen, draaien ze de helix achter zich aan, wat een spanning creëert die vergelijkbaar is met een rubber band die te strak is opgewonden. Deze spanning is niet slechts een passief bijproduct; het is een krachtige kracht die het DNA-molecuul zelf kan hervormen. Onder de juiste omstandigheden kan deze stress ervoor zorgen dat de dubbele helix uit elkaar klapt, binnenstebuiten keert of zich vouwt tot complexe, niet-standaard vormen. Er wordt gedacht dat deze alternatieve structuren fungeren als schakelaars, die genen aan- of uitzetten, maar decennialang hebben wetenschappers gestreden om precies te zien hoe deze vormen ontstaan, hoe ze met elkaar interageren en hoe de fysieke spanning over een enkel DNA-molecuul wordt verdeeld.

Een team onderzoekers van de National Institutes of Health heeft nu een nieuwe methode ontwikkeld om deze gebeurtenissen op individuele DNA-moleculen te observeren met ongekende helderheid. Ze creëerden een techniek genaamd P2-seq, die een chemische kleurstof combineert die open of instabiele delen van het DNA accentueert met een krachtige sequencing-technologie die lange strengen genetische code in één keer leest. Door het DNA te behandelen met een chemische stof die alleen de basen markeert die tijdelijk van hun partners zijn gescheiden, en vervolgens het gehele molecuul te lezen, konden de onderzoekers exact in kaart brengen waar het DNA gedraaid, gesmolten of gevouwen was. Deze aanpak stelde hen in staat om niet alleen het gemiddelde gedrag van een menigte DNA-moleculen te zien, maar ook het unieke verhaal van elke individuele streng, waardoor zij ontdekten hoe verre delen van hetzelfde molecuul met elkaar communiceren en strijden om de beschikbare fysieke spanning.

De onderzoekers begonnen door circulaire DNA-plasmiden te nemen en hun niveau van draaiing zorgvuldig aan te passen, waarbij ze een reeks moleculen creëerden van ontspannen tot strak opgewonden. Vervolgens pasten ze een chemische behandeling toe die specifiek reageert met thymine-basen wanneer deze blootgesteld zijn, wat gebeurt wanneer de DNA-streng opent of een niet-standaard vorm aanneemt. Met behulp van een nanopore-sequencer lieten ze deze behandelde moleculen door minuscule poriën passeren, waarbij ze de elektrische stroom maten terwijl ze passeerden. Omdat de chemische markering de stroom op een duidelijke manier veranderde, kon het team precies bepalen welke basen waren gemodificeerd. Om de enorme hoeveelheid ruwe data te interpreteren, ontwikkelden ze een nieuwe computationele tool die de signalen van behandelde DNA vergeleken met onbehandelde controles, waardoor ze deze subtiele veranderingen konden detecteren zonder de noodzaak om kunstmatige referentiekansen te synthetiseren.

Wat naar voren kwam uit dit hoogresolutie-perspectief was een dynamisch landschap van structurele veranderingen. Het team ontdekte dat naarmate het DNA meer gedraaid werd, specifieke regio's zouden uit elkaar klappen of zich zouden vouwen in vormen zoals kruisvormen (cruciforms), die eruitzien als kruisen. Cruciaal was dat zij observeerden dat deze structurele veranderingen geen willekeurige of onafhankelijke gebeurtenissen waren. In plaats daarvan ontdekten de onderzoekers een directe competitie tussen verre delen van hetzelfde molecuul. Wanneer een bepa === sectie de draaiingsspanning absorbeerde door een stabiele structuur te vormen, verminderde dit de hoeveelheid spanning die beschikbaar was voor andere secties om van vorm te veranderen. Bijvoorbeeld, als een specifiek gebied ver weg van een vouwplaats begon te smelten en uit elkaar te klappen, voorkwam dit dat een nabijgelegen kruisvormige structuur zich vormde. Dit leverde het eerste directe bewijs op enkel-molecuulniveau dat verschillende DNA-elementen binnen hetzelfde topologische domein invers gekoppeld zijn en strijden om een gedeelde pool van fysieke energie.

De studie onthulde ook dat DNA de spanning niet altijd verlicht door grote, duidelijke structuren te vormen. In veel gevallen detecteerden de onderzoekers een subtielere, gedistribueerde vorm van spanning waarbij de dubbele helix over zijn gehele lengte licht instabiel werd, in plaats van alleen op specifieke hotspots. Deze "backbone"-reactiviteit nam toe naarmate de totale draaiing toenam, maar nam af wanneer stabiele structuren zoals kruisvormen ontstonden, wat suggereert dat het molecuul twee manieren heeft om spanning te verwerken: ofwel door een paar sterke, gelokaliseerde vormen te creëren, ofwel door de instabiliteit over een breed gebied te verspreiden. De onderzoekers waren in staat om te volgen hoe de balans tussen deze twee modi verschoof wanneer ze slechts één extra draai aan het DNA toevoegden, wat aantoonde dat het molecuul zijn spanning op een niet-lineaire, zeer specifieke manier herverdeelt.

Door naar individuele moleculen te kijken, was het team ook in staat om zeldzame, vluchtige intermediaire toestanden te vangen die meestal verborgen blijven bij bulkmetingen. Ze identificeerden specifieke stappen in het vouwproces van kruisvormige structuren, waarbij ze moleculen zagen die betrapt werden tijdens het vormen van een haarspeldlus voordat deze volledig uitgestreden was. Ze ontdekten dat het pad dat een molecuul aflegt bij het vouwen afhangt van de chemische omgeving, waarbij verschillende zoutcondities verschillende vouwroutes bevoordelen. Dit niveau van detail stelde hen in staat om de vouwpaden te reconstrueren en te zien dat meerdere structurele toestanden op hetzelfde molecuul kunnen co-existeren, afhankelijk van de exacte hoeveelheid draaiing en de lokale sequentie.

De bevindingen suggereren dat DNA-topologie fungeert als een drager van regulatoire informatie, waarbij fysieke signalen over lange afstanden binnen een gen-domein worden overgebracht. Het vermogen om deze interacties op enkel-molecuulniveau te observeren, verandert de manier waarop wetenschappers de mechanica van het genoom begrijpen. Het toont aan dat de fysieke staat van DNA niet een statische achtergrond is, maar een dynamisch, competitief systeem waarin verre elementen elkaar direct beïnvloeden. De nieuwe methode, P2-seq, biedt een manier om deze structurele toestanden en hun koppeling met bijna nucleotide-precisie in kaart te brengen, wat een kader biedt om te bestuderen hoe de fysieke vorm van DNA de functie in gezondheid en ziekte beïnvloedt. Hoewel de experimenten werden uitgevoerd op circulair DNA in een reageerbuis, wordt verwacht dat de principes van hoe spanning wordt verdeeld en gedeeld van toepassing zijn op het complexe, lineaire DNA dat in levende cellen wordt gevonden, wat de deur opent naar het begrijpen van hoe de fysieke krachten van het genoom biologische processen aansturen.