A sequential variant prioritization to identify genetic causes of hereditary angioedema in affected families from Spain and Portugal

技术摘要：西班牙与葡萄牙遗传性血管性水肿的序列变异优先级排序研究

问题陈述
遗传性血管性水肿（HAE）是一种罕见的常染色体显性遗传疾病，其特征是由于缓激肽调节失衡导致的反复性水肿发作。虽然大多数病例归因于 SERPING1（编码 C1 抑制剂）或 F12（编码 XII 因子）的变异，但很大一部分患者——特别是那些 C1 抑制剂水平正常的患者（HAE-nC1INH）——缺乏分子诊断依据。目前的诊断常规通常依赖于蛋白质水平的检测，但这可能导致结果不确定或误诊，从而延误治疗。此外，尽管二代测序（NGS）扩展了已知的遗传图谱，但诊断率仍然处于较低水平，尤其是在没有家族史的散发病例中。因此，迫切需要进行全面的遗传学表征，以完善诊断策略，并扩大在西班牙和葡萄牙等代表性不足的人群中的突变谱。

方法论
本研究对来自西班牙和葡萄牙岛屿的 102 个独立家族（170 人）的队列采用了序列变异优先级排序策略。工作流程如下：

1. 全外显子组测序 (WES)： 从外周血中提取 DNA 并使用 Illumina 仪器进行测序，中位深度达到 118.3X。
2. 两级优先级排序管线：
   • 第一级（已知基因）： 利用内部开发的遗传性血管性水肿数据库注释（HADA）工具，对七个已知的 HAE 相关基因（SERPING1, F12, ANGPT1, PLG, KNG1, HS3ST6, MYOF）进行筛选。此阶段侧重于识别已知致病变异以及这些既定位点内的创新变异。
   • 第二级（探索性面板）： 对于第一级未解决的病例，应用 Franklin 平台进行虚拟基因面板分析。该面板针对参与激肽-激酶系统（KKS）和补体途径的基因（例如 DAB2IP, C5, TEK, VEGFA），优先考虑人群等位基因频率低（<0.01）且预测致病性高（CADD 分数超过基因特异性突变显著性阈值）的变异。
3. 验证与分离分析： 通过 Sanger 测序对候选变异进行验证。在有家系成员可用时进行分离分析，以评估变异是否与疾病表型共分离。
4. 专门化分析： 管线包括使用 MELT 和 SCRAMble 对 SERPING1 中的移动元件插入（Alu 元件）进行特定筛查，以及使用 SQUIRLS 和 DECIPHER 进行剪接影响预测。

关键结果

• 诊断率： 研究识别出 28 个致病或可能致病（P/LP）的变异。多发病例的诊断率（88.3%）显著高于仅针对先证者的病例（21.1%），这强调了在筛查中纳入不受影响的家系成员的价值。
• 新发现： 分析揭示了 7 个新的 SERPING1 变异和 2 个新的 F12 变异。值得注意的发现包括一个新的 SERPING1 剪接变异和一个预测会触发无义介导的 mRNA 降解（NMD）的重复事件。
• 候选变异： 在缺乏已知基因突变的病例中，第二级分析优先考虑了涉及 C5, TEK, ANGPT2 和 KRT1 等基因的候选变异。具体而言，在四个无关的散发病例中发现了一个 C5 的剪接位点变异（c.3151_3154+2del），并且在一个家族中观察到 TEK 错义变异呈现完全共分离，提示其在 HAE-nC1INH 发病机制中具有潜在作用。
• 流行病学观察： 研究注意到葡萄牙患者中 HAE 2 型（功能性 C1-INH）的患病率极高（40%），显著高于全球估计值（10–15%）。
• 重新分类： 遗传学分析成功地对血清学特征模糊的病例进行了重新分类，例如家族 97，最初临床怀疑为 HAE-C1INH 1 型，但在鉴定出 F12 变异后被修正为 HAE-nC1INH。

意义与主张
作者声称，这项研究是迄今为止对西班牙和葡萄牙 HAE 最全面的遗传学表征。通过将 WES 与序列优先级排序框架相结合，本研究扩展了 HAE 的已知突变谱，并提出了与激肽途径相互作用的基因的新候选变异。论文断言，应将遗传检测确立为第一层级的诊断工具，以减少诊断延迟并实现精准管理，特别是对于 C1 抑制剂水平正常的患者。研究结果强化了家系分离分析在提高诊断率方面的重要性，并强调了当前基于蛋白质的检测方法在解决模糊病例方面的局限性。作者强调，虽然第二级中识别的候选变异需要功能验证，但它们为重新评估 HAE 的分子多样性提供了框架，并表明为了填补剩余的诊断空白，有必要将遗传筛查扩展到经典基因之外。