A sequential variant prioritization to identify genetic causes of hereditary angioedema in affected families from Spain and Portugal

Resumo Técnico: Priorização Sequencial de Variantes para Angioedema Hereditário na Espanha e Portugal

Definição do Problema
O angioedema hereditário (AH) é um distúrbio autossômico dominante raro, caracterizado por ataques de edema recorrentes mediados pela desregulação da bradicinina. Embora a maioria dos casos seja atribuída a variantes em SERPING1 (que codifica o inibidor de C1) ou F12 (que codifica o Fator XII), uma proporção significativa de pacientes — particularmente aqueles com níveis normais de inibidor de C1 (AH-nC1INH) — carece de um diagnóstico molecular. As rotinas diagnósticas atuais dependem frequentemente de ensaios de nível proteico, que podem ser inconclusivos ou levar ao erro diagnóstico, resultando em atraso no tratamento. Além disso, embora o sequenciamento de nova geração (NGS) tenha expandido o panorama genético conhecido, o rendimento diagnóstico permanece subótimo, especialmente em casos esporádicos sem histórico familiar. Existe uma necessidade crítica de caracterização genética abrangente para refinar as estratégias diagnósticas e expandir o espectro mutacional do AH em populações sub-representadas, especificamente na Espanha e em Portugal.

Metodologia
O estudo empregou uma estratégia de priorização sequencial de variantes em uma coorte de 102 famílias independentes (170 indivíduos) da Espanha e do Portugal continental. O fluxo de trabalho envolveu:

1. Sequenciamento do Exoma Completo (WES): O DNA foi extraído de sangue periférico e sequenciado utilizando instrumentos Illumina, atingindo uma profundidade mediana de 118,3X.
2. Pipeline de Priorização de Dois Níveis:
   • Nível 1 (Genes Estabelecidos): Utilizou a ferramenta de anotação in-house Hereditary Angioedema Database Annotation (HADA) para rastrear sete genes conhecidos associados ao AH (SERPING1, F12, ANGPT1, PLG, KNG1, HS3ST6, MYOF). Este nível focou na identificação de variantes patogênicas conhecidas e variantes novas dentro destes loci estabelecidos.
   • Nível 2 (Painel Exploratório): Para os casos não resolvidos no Nível 1, um painel de genes virtuais foi aplicado utilizando a plataforma Franklin. Este painel visou genes envolvidos no sistema cinina-calicreína (KKS) e nas vias do complemento (ex: DAB2IP, C5, TEK, VEGFA), priorizando variantes com baixas frequências alélicas populacionais (<0,01) e alta deleteriedade prevista (pontuações CADD superiores aos limites de significância mutacional específicos de cada gene).
3. Validação e Segregação: As variantes candidatas foram validadas via sequenciamento de Sanger. A análise de segregação foi realizada onde membros da família estavam disponíveis para avaliar a co-segregação com o fenótipo da doença.
4. Análise Especializada: O pipeline incluiu o rastreio específico de inserções de elementos móveis (elementos Alu) em SERPING1 usando MELT e SCRAMble, e a previsão de impacto no splicing usando SQUIRLS e DECIPHER.

Resultados Principais

• Rendimento Diagnóstico: O estudo identificou 28 variantes patogênicas ou provavelmente patogênicas (P/LP). O rendimento diagnóstico foi significativamente maior em famílias multiplex (88,3%) comparado a casos de apenas o probando (21,1%), ressaltando o valor de incluir membros familiares não afetados na triagem.
• Novas Descobertas: A análise revelou sete novas variantes de SERPING1 e duas novas variantes de F12. Entre os achados notáveis, destacam-se uma nova variante de splicing em SERPING1 e um evento de duplicação previsto para desencadear o Nonsense-Mediated Decay (NMD).
• Variantes Candidatas: Nos casos sem mutações em genes estabelecidos, a análise de Nível 2 priorizou variantes candidatas em genes como C5, TEK, ANGPT2 e KRT1. Especificamente, uma variante de sítio de splice em C5 (c.3151_3154+2del) foi encontrada em quatro casos esporádicos não relacionados, e uma variante de sentido trocado (missense) em TEK mostrou co-segregação completa em uma família, sugerindo um papel na patogênese do AH-nC1INH.
• Observações Epidemiológicas: O estudo notou uma prevalência marcante de AH tipo 2 (C1-INH disfuncional) em pacientes portugueses (40%), significativamente superior às estimativas globais (10–15%).
• Reclassificação: A análise genética reclassificou com sucesso casos com perfis sorológicos ambíguos, como a Família 97, onde uma suspeita clínica inicial de AH-C1INH tipo 1 foi revisada para AH-nC1INH com base na identificação de uma variante em F12.

Significância e Alegações
Os autores afirmam que este estudo representa a caracterização genética mais abrangente do AH na Espanha e em Portugal até à data. Ao integrar o WES com uma estrutura de priorização sequencial, o estudo expande o espectro mutacional conhecido do AH e propõe novas variantes candidatas em genes que interagem com a via da bradicinina. O artigo defende que o teste genético deve ser estabelecido como uma ferramenta diagnóstica de primeiro nível para reduzir os atrasos diagnósticos e permitir um manejo preciso, particularmente para pacientes com níveis normais de inibidor de C1. Os resultados reforçam a importância da análise de segregação familiar para melhorar o rendimento diagnóstico e destacam as limitações dos atuais ensaios baseados em proteínas para resolver casos ambíguos. Os autores enfatizam que, embora as variantes candidatas identificadas no segundo nível requeiram validação funcional, elas fornecem uma estrutura para reavaliar a diversidade molecular do AH e sugerem que expandir a triagem genética para além dos genes canônicos é necessário para abordar a lacuna diagnóstica remanescente.