A sequential variant prioritization to identify genetic causes of hereditary angioedema in affected families from Spain and Portugal

Technisches Resümee: Sequenzielle Variantenpriorisierung bei hereditärem Angioödem in Spanien und Portugal

Problemstellung
Das hereditäre Angioödem (HAE) ist eine seltene autosomal-dominante Erkrankung, die durch rezidivierende Ödemattacken gekennzeichnet ist, welche durch eine Bradykinin-Dysregulation vermittelt werden. Während die Mehrheit der Fälle auf Varianten in SERPING1 (kodiert für den C1-Inhibitor) oder F12 (kodiert für Faktor XII) zurückzuführen ist, fehlt einem signifikanten Anteil der Patienten – insbesondere jenen mit normalem C1-Inhibitor-Spiegel (HAE-nC1INH) – eine molekulare Diagnose. Derzeitige diagnostische Routinen stützen sich oft auf Protein-Assays, die unschlüssig sein können oder zu Fehldiagnosen führen können, was eine verzögerte Behandlung zur Folge hat. Obwohl die Next-Generation-Sequencing (NGS) die bekannte genetische Landschaft erweitert hat, bleibt die diagnostische Ausbeute suboptimal, insbesondere bei sporadischen Fällen ohne Familienanamnese. Es besteht ein kritischer Bedarf an einer umfassenden genetischen Charakterisierung, um die diagnostischen Strategien zu verfeinern und das Mutationsspektrum von HAE in unterrepräsentierten Populationen, speziflich in Spanien und Portugal, zu erweitieren.

Methodik
Die Studie verwendete eine sequenzielle Strategie zur Priorisierung von Varianten an einer Kohorte von 102 unabhängigen Familien (170 Individuen) aus Spanien und dem portugiesischen Festland sowie den Inseln. Der Workflow umfasste:

1. Voll-Exom-Sequenzierung (WES): DNA wurde aus peripherem Blut extrahiert und mittels Illumina-Instrumenten sequenziert, wobei eine mediane Tiefe von 118,3X erreicht wurde.
2. Zweistufiges Priorisierungs-Pipeline:
   • Stufe 1 (Etablierte Gene): Nutzung des hauseigenen Hereditary Angioedema Database Annotation (HADA)-Tools, um sieben bekannte HAE-assoziierte Gene (SERPING1, F12, ANGPT1, PLG, KNG1, HS3ST6, MYOF) zu screenen. Diese Stufe konzentrierte sich auf die Identifizierung bekannter pathogener Varianten sowie neuartiger Varianten innerhalb dieser etablierten Loci.
   • Stufe 2 (Exploratives Panel): Für Fälle, die in Stufe 1 ungelöst blieben, wurde ein virtuelles Gen-Panel unter Verwendung der Franklin-Plattform angewendet. Dieses Panel targetierte Gene, die am Kinin-Kallikrein-System (KKS) und an Komplementwegen beteiligt sind (z. B. DAB2IP, C5, TEK, VEGFA), wobei Varianten mit niedrigen Populations-Allel-Frequenzen (<0,01) und hoher vorhergesagter Deleterität (CADD-Scores über den gen-spezifischen Mutational Significance Cutoffs) priorisiert wurden.
3. Validierung und Segregation: Kandidatenvarianten wurden mittels Sanger-Sequenzierung validiert. Eine Segregationsanalyse wurde durchgeführt, sofern Familienmitglieder verfügbar waren, um die Ko-Segregation mit dem Krankheitsphänotyp zu bewerten.
4. Spezialisierte Analyse: Die Pipeline beinhaltete ein spezifisches Screening auf mobile Element-Insertionen (Alu-Elemente) in SERPING1 unter Verwendung von MELT und SCRAMble sowie eine Vorhersage der Spleiß-Auswirkungen mittels SQUIRLS und DECIPHER.

Hauptergebnisse

• Diagnostische Ausbeute: Die Studie identifizierte 28 pathogene oder wahrscheinlich pathogene (P/LP) Varianten. Die diagnostische Ausbeute war in Multiplex-Familien (88,3 %) signifikant höher als in Probanden-Einzelverläufen (21,1 %), was den Wert der Einbeziehung nicht betroffener Familienmitglieder in das Screening unterstreicht.
• Neu entdeckungen: Die Analyse enthüllte sieben neuartige SERPING1-Varianten und zwei neuartige F12-Varianten. Zu den bemerkenswerten Befunden gehörten eine neuartige Spleiß-Variante in SERPING1 und ein Duplikationsereignis, das eine Nonsense-Mediated Decay (NMD) auszulösen vorhersagt.
• Kandidatenvarianten: In Fällen, in denen keine Mutationen in etablierten Genen vorlagen, priorisierte die Analyse der Stufe 2 Kandidatenvarianten in Genen wie C5, TEK, ANGPT2 und KRT1. Speziell wurde eine Splice-Site-Variante in C5 (c.3151_3154+2del) in vier nicht verwandten sporadischen Fällen gefunden, und eine TEK-Missense-Variante zeigte eine vollständige Ko-Segregation in einer Familie, was auf eine Rolle in der Pathogenese von HAE-nC1INH hindeutet.
• Epidemiologische Beobachtungen: Die Studie stellte eine auffällige Prävalenz von HAE Typ 2 (dysfunktionaler C1-INH) bei portugiesischen Patienten (40 %) fest, was signifikant höher ist als die globalen Schätzungen (10–15 %).
• Reklassifizierung: Die genetische Analyse ermöglichte die erfolgreiche Reklassifizierung von Fällen mit ambivalenten serologischen Profilen, wie etwa Familie 97, bei der ein anfänglicher klinischer Verdacht auf HAE-C1INH Typ 1 aufgrund der Identifizierung einer F12-Variante zu HAE-nC1INH revidiert wurde.

Bedeutung und Ansprüche
Die Autoren behaupten, dass diese Studie die umfassendste genetische Charakterisierung von HAE in Spanien und Portugal bis dato darstellt. Durch die Integration von WES mit einem sequenziellen Priorisierungsrahmen erweitert die Studie das bekannte Mutationsspektrum von HAE und schlägt neue Kandidatenvarianten in Genen vor, die mit dem Bradykinin-Weg interagieren. Die Arbeit postuliert, dass genetische Tests als Erstlinien-Diagnosewerkzeug etabliert werden sollten, um diagnostische Verzögerungen zu reduzieren und ein präzises Management zu ermöglichen, insbesondere für Patienten mit normalen C1-Inhibitor-Spiegeln. Die Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der familiären Segregationsanalyse zur Verbesserung der diagnostischen Ausbeute und heben die Limitationen aktueller proteinbasierter Assays bei der Klärung ambivalenter Fälle hervor. Die Autoren betonen, dass die identifizierten Kandidatenvarianten der zweiten Stufe zwar einer funktionellen Validierung bedürfen, jedoch einen Rahmen für die Re-Evaluierung der molekularen Diversität von HAE bieten und darauf hindeuten, dass eine Erweiterung des genetischen Screenings über kanonische Gene hinaus notwendig ist, um die verbleibende diagnostische Lücke zu schließen.