A sequential variant prioritization to identify genetic causes of hereditary angioedema in affected families from Spain and Portugal

Technische Samenvatting: Sequentiële Variant Prioritering voor Hereditair Angio-oedeem in Spanje en Portugal

Probleemstelling
Hereditair angio-oedeem (HAO) is een zeldzame autosomaal dominante aandoening die wordt gekenmerkt door recidiverende oedeemaanvallen die worden gemedieerd door bradykinine-dysregulatie. Hoewel de meerderheid van de gevallen wordt toegeschreven aan varianten in SERPING1 (coderend voor C1-inhibitor) of F12 (coderend voor Factor XII), mist een aanzienlijk deel van de patiënten — met name die met normale C1-inhibitorwaarden (HAO-nC1INH) — een moleculaire diagnose. Huidige diagnostische routines vertrouwen vaak op eiwitgebaseerde assays, die inconclusief kunnen zijn of kunnen leiden tot een foutieve diagnose, wat resulteert in een vertraagde behandeling. Hoewel Next-Generation Sequencing (NGS) het bekende genetische landschap heeft uitgebreid, blijft de diagnostische opbrengst vaak suboptimaal, vooral bij sporadische gevallen zonder familiegeschiedenis. Er is een kritieke behoefte aan uitgebreide genetische karakterisering om diagnostische strategieën te verfijnen en het mutatiespectrum van HAO uit te breiden in ondervertegenwoordigde populaties, specifiek binnen Spanje en Portugal.

Methodologie
De studie maakte gebruik van een sequentiële variant-prioriteringsstrategie op een cohort van 102 onafhankelijke families (170 individuen) uit Spanje en insulair Portugal. De workflow omvatte:

1. Whole-Exome Sequencing (WES): DNA werd geëxtraheerd uit perifeer bloed en gesequenced met behulp van Illumina-instrumenten, waarbij een mediane diepte van 118,3X werd bereikt.
2. Twee-niveau Prioriteringspipeline:
   • Niveau 1 (Gevestigde genen): Maakte gebruik van de interne Hereditary Angioedema Database Annotation (HADA) tool om zeven bekende HAO-geassocieerde genen (SERPING1, F12, ANGPT1, PLG, KNG1, HS3ST6, MYOF) te screenen. Dit niveau richtte zich op het identificeren van bekende pathogene varianten en nieuwe varianten binnen deze gevestigde loci.
   • Niveau 2 (Exploratieve panel): Voor gevallen die in Niveau 1 onopgelost bleven, werd een virtueel genenpanel toegepast met behulp van het Franklin-platform. Dit panel richtte zich op genen die betrokken zijn bij het kinine-kallikreïne-systeem (KKS) en complementpaden (bijv. DAB2IP, C5, TEK, VEGFA), waarbij prioriteit werd gegeven aan varianten met een lage populatie-allelfrequentie (<0,01) en een hoge voorspelde schadelijkheid (CADD-scores boven de gen-specifieke Mutational Significance Cutoffs).
3. Validatie en Segregatie: Kandidaatvarianten werden gevalideerd via Sanger-sequencing. Segregatieanalyse werd uitgevoerd waar familieleden beschikbaar waren om co-segregatie met het ziektefenotype te beoordelen.
4. Gespecialiseerde Analyse: De pipeline bevatte specifieke screening voor mobiele element-inserties (Alu-elementen) in SERPING1 met behulp van MELT en SCRAMble, en splicing-impactvoorspelling met behulp van SQUIRLS en DECIPHER.

Belangrijkste Resultaten

• Diagnostische Opbrengst: De studie identificeerde 28 pathogene of waarschijnlijk pathogene (P/LP) varianten. De diagnostische opbrengst was significant hoger in multiplex-families (88,3%) vergeleken met proband-alleen gevallen (21,1%), wat de waarde van het opnemen van niet-aangedane familieleden in de screening onderstreept.
• Nieuwe Ontdekkingen: De analyse onthulde zeven nieuwe SERPING1-varianten en twee nieuwe F12-varianten. Opvallende bevindingen waren een nieuwe splicing-variant in SERPING1 en een duplicatie-event dat voorspeld wordt een Nonsense-Mediated Decay (NMD) te triggeren.
• Kandidaatvarianten: In gevallen zonder mutaties in gevestigde genen, prioriteerde de Niveau 2-analyse kandidaatvarianten in genen zoals C5, TEK, ANGPT2 en KRT1. Specifiek werd een splice-site variant in C5 (c.3151_3154+2del) gevonden in vier ongerelateerde sporadische gevallen, en een TEK missense variant vertoonde volledige co-segregatie in één familie, wat wijst op een rol in de HAO-nC1INH pathogenese.
• Epidemiologische Observaties: De studie merkte een opvallende prevalentie op van HAO type 2 (dysfunctionele C1-INH) bij Portugese patiënten (40%), wat aanzienlijk hoger is dan de wereldwijde schattingen (10–15%).
• Reclassificatie: Genetische analyse slaagde er succesvol in om gevallen met ambigue serologische profielen te herclassificeren, zoals Familie 97, waarbij een initiële klinische verdenking op HAO-C1INH type 1 werd herzien naar HAO-nC1INH op basis van de identificatie van een F12-variant.

Betekenis en Claims
De auteurs beweren dat deze studie de meest uitgebreide genetische karakterisering van HAO in Spanje en Portugal tot nu toe is. Door WES te integreren met een sequentieel prioriteringskader, breidt de studie het bekende mutatiespectrum van HAO uit en stelt zij nieuwe kandidaatvarianten voor in genen die interageren met het bradykininepad. Het artikel stelt dat genetische testen moet worden gevestigd als een eerstelijns diagnostisch instrument om diagnostische vertragingen te verminderen en nauwkeurig beheer mogelijk te maken, met name voor patiënten met normale C1-inhibitorwaarden. De bevindingen bevestigen het belang van familiale segregatieanalyse om de diagnostische opbrengst te verbeteren en benadrukken de beperkingen van de huidige eiwitgebaseerde assays bij het oplossen van ambigue gevallen. De auteurs benadrukken dat hoewel de geïdentificeerde kandidaatvarianten in de tweede fase functionele validatie vereisen, zij een kader bieden voor het herevalueren van de moleculaire diversiteit van HAO en suggereren dat het uitbreiden van genetische screening buiten de canonieke genen noodzakelijk is om de resterende diagnostische kloof te overbruggen.