A preregistered test that outcome-permuted data also pass: mathematical coupling in a pan-cancer analysis of proliferation adjustment in prognostic gene expression studies
本研究通过一项预注册的泛癌分析表明，关于预后基因表达研究中数学耦合的假设在很大程度上是由于构建本身而得到证实的，因为即使将测试标准应用于结果置换后的零假设数据，其标准依然得到满足，这凸显了针对置换结果的分析流程进行验证以避免错误混杂结论的至关重要性。
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在癌症研究领域，科学家经常寻找特定的基因，这些基因就像是预警信号，指示着患者疾病的发展趋势。通过分析肿瘤中这些基因的活性，研究人员希望能够预测患者的生存期长短。然而，肿瘤是复杂的，其行为受多种因素影响，例如患者的年龄、肿瘤的大小以及癌细胞分裂的速度。该领域面临的一个主要挑战是，如何区分一个真正具有生存预测能力的独特基因，与一个仅仅反映了肿瘤生长总体速度的基因。如果研究人员忘记考虑癌症分裂的速度，他们可能会错误地将某种结果归功于某个特定基因，而实际上，那个基因只是快速移动的细胞分裂列车上的一个乘客。这个问题被称为“数学耦合”（mathematical coupling），即两种测量值仅仅因为它们是用相同的基础数据计算出来的而被联系在一起，从而产生一种虚假的关联感。
一位名叫 Soon Woo Nam 的研究人员开始测试一个关于这些基因列表是如何创建的，以及标准统计方法是否会意外地证实一个并不存在的模式。这项研究专注于来自二十个不同癌症患者组的大型数据集，涵盖了十四种癌症类型和近五千名个体。目标是观察：如果对“增殖评分”（一个衡量癌细胞分裂速度的指标）进行调整，是否会改变那些表现出具有生存预测能力的基因列表。该研究者有一个预注册计划（preregistered plan），这意味着分析规则在查看数据之前就已经写好了，以确保过程公平透明。该计划预测，当细胞分裂速度被加入到统计模型中时，其他基因的估计重要性将在所有不同的癌症类型中发生非常特定且可预测的变化。
当在实际患者数据上运行分析时，结果完美符合预测。数据显示，基因的重要性性的变化完全符合计划中的预测，并且这种模式在每一个癌症组中都成立。乍看之下，这似乎有力地证实了该统计方法按预期发挥作用。然而，研究者随后进行了一项在类似研究中极少进行的关键检查。他们采用了相同的数据并对生存结果进行了“洗牌”（shuffled）——本质上是随机化了谁生存、谁死亡——使得任何基因都不可能成为真实的生存预测因子。在这个没有任何变量起作用的随机版本中，研究者再次运行了相同的统计测试。令人惊讶的是，该测试竟然也通过了。洗牌后的数据满足了与真实数据相同的所有标准，即便其中没有任何真实的生物学信号，它依然证实了那种模式。
这一发现揭示了这类测试在解释方式上的一个根本缺陷。研究者所寻找的模式并不是生物学关系的体现，也不是一种被称为“混杂”（confounding）的特定类型误差。相反，这种模式是“内置”在数学本身之中的。因为新的测量值（细胞分裂速度）是从用于计算其他基因的相同基因数据中衍生出来的，所以统计模型在数学上被迫显示出一种关系，无论这种关系是真实的还是虚假的。该测试对这种数学结构如此敏感，以至于它无法区分真实的生物学效应与随机打乱的数字。事实上，在一百次随机试验中，有九十二次该测试都会通过，尽管当时其实什么都没有发生。
研究还观察了当模型中加入不同因素时，重要基因列表是如何变化的。当研究人员在计算中加入癌症阶段（即癌症扩散的程度）或细胞分裂速度时，表现为显著预测因子的基因数量急剧下降。在某些情况下，加入这些因素使得原本看起来很重要的基因减少了一半以上。这表明，“预后基因”列表并非一组固定的生物学真相，而是一个高度依赖于研究人员在模型中选择包含哪些其他因素的列表。如果研究人员没有在计算中考虑肿瘤分裂的速度，他们可能会在列表中包含许多仅仅是在反映该速度的基因，而不是提供关于患者未来的独特信息。
最终的结论是，一个预注册的假设可以仅仅通过数据的构建方式得到证实，而不是因为该假设本身是正确的。研究者证明，在最终确定分析计划之前，先对置换数据（permuted data，即随机化处理后的数据）进行测试，就能立即暴露这个问题。如果当没有任何实际情况发生时测试依然通过，那么当使用真实数据时，该测试就无法被用来证明确实发生了某些情况。该研究提醒我们，在复杂的基因研究中，重要基因的列表对分析过程中所做的选择高度敏感。研究人员需要透明地说明他们调整了哪些因素，并且应当理解，改变这些因素会极大地改变结果，有时甚至会移除最初看似显著的基因中的三分之二。
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