MERFISH-based pooled genetic screening reveals cell non-autonomous phenotypes in intact tissue

لا تعيش الخلايا في عزلة؛ فداخل العضو الواحد، توجد الخلايا ضمن حي سكني مزدحم ومنظم، حيث يشكل موقعها وشكلها وتواصلها المستمر مع جيرانها سلوكها. لعقود من الزمن، تمكن العلماء من دراسة كيفية تأثير تغيير جين واحد على الخلية، لكن القيام بذلك بطريقة تحافظ على موقع الخلية الأصلي وعلاقتها بالنسيج المحيط بها كان يمثل عقبة رئيسية. تتطلب الطرق التقليدية إخراج الخلايا من الجسم، وتفكيكها، وقراءة شفرتها الوراثية في أنبوب اختبار، وهذه العملية تدمر الخريطة التي توضح أين كانت الخلية ومن هم جيرانها. ولفهم كيف تتردد أصداء التغيير الجيني عبر نسيج حي، احتاج الباحثون إلى وسيلة للنظر داخل العضو السليم، وتحديد الخلايا التي تم تعديلها، ورؤية كيف أثرت تلك التغييرات على الخلايا المجاورة لها مباشرة، كل ذلك دون فقدان السياق المكاني.

قام فريق من الباحثين في جامعة هارفارد ومعهد هوارد هيوز الطبي بتطوير تقنية تصوير جديدة تحل هذه المشكلة. فقد ابتكروا طريقة لإجراء مسوحات جينية واسعة النطلة مباشرة داخل نسيج كبد فأر سليم. وباستخدام نظام تصوير عالي الدقة يسمى MERFISH، تمكنوا من تتبع الهوية الجينية للخلايا الفردية، وقياس حالتها الجزيئية الداخلية، ورسم خريطة لموقعها الدقيق بالنسبة لجيرانها. وكان الابتكار الرئيسي يتمثل في طريقة لقراءة "الباركودات" الجينية التي تحدد أي الخلايا قد تم تعديلها، دون استخدام خطوات كيميائية معقدة لتضخيم الإشارة. هذا التبسيط سمح لهم برصد عدد أكبر بكثير من العلامات الجينية والرسائل الخلوية مقارنة بالطرق السابقة، مما مكنهم من توصيف 1.5 مليون خلية في تجربة واحدة. والنتيجة هي خريطة تفصيلية ثلاثية الأبعاد لا تظهر فقط كيف تغير الخلية المعدلة نفسها، بل كيف تعيد تشكيل البيئة المحلية المحيطة بها بالكامل.

بدأ الباحثون بتطوير أدواتهم لتعمل دون الحاجة إلى التضخيم الإنزيمي، وهي عملية كيميائية تُستخدم غالباً لتعزيز الإشارات الضعيفة في التصوير. في عملهم السابق، كان عليهم استخدام الإنزيمات لمضاعفة الباركودات الجينية المرتبطة بالخلايا التي أرادوا دراستها، لكن ذلك أضاف خطوات أدت أحياناً إلى تقليل وضوح البيانات. واكتشفوا أنه من خلال تصميم باركودات جينية أقصر وأكثر دمجاً والاعتماد على الوفرة الطبيعية لهذه الجزيئات داخل الخلية، يمكنهم اكتشافها مباشرة من خلال التهجين البسيط. وقد ثبت أن هذا النهج المباشر أكثر كفاءة بشكل كبير؛ حيث استعاد قرابة عشرة أضعاف من الباركودات الجينية ومرتين ونصف من الرسائل الخلوية لكل خلية مقارنة بطريقتهم القديمة. هذا التحسن يعني أنه بمقدورهم تحديد الهوية الجينية لعدد أكبر بكثير من الخلايا ورصد التغيرات الطفيفة في النشاط الجيني التي كانت غير مرئية سابقاً.

ومع امتلاك هذا النظام المحسن، توجه الفريق إلى كبد الفأر، وهو عضو معقد يتكون من أنواع عديدة من الخلايا التي تعمل معاً. قاموا بإدخال مكتبة من التعليمات الجينية في كبد فئران صغيرة، مستهدفين حوالي 200 جين محدد في خلايا الكبد المعروفة باسم الخلايا الكبدية (hepatocytes). تلقت كل خلية كبدية باركوداً جينياً فريداً يعمل كعلامة، مما سمح للباحثين بمعرفة أي جين تم تعديله في تلك الخلية تحديداً. وبعد نمو الفئران وظهور الآثار الناجمة عن التغييرات الجينية، قام الباحثون بتقطيع نسيج الكبد واستخدموا نظام التصوير الخاص بهم لمسح العضو بأكله. حددوا الهوية الجينية لكل خلية، وقاسوا نشاط مئات الجينات داخلها، وسجلوا موقعها الدقيق في النسيج. وفي المجمل، قاموا بتحليل أكثر من 1.5 مليون خلية، مما خلق مجموعة بيانات ضخمة تربط بين التغيرات الجينية والحالات الخلوية والمواقع المكانية.

كشفت الدراسة عن نوعين متميزين من التأثيرات. أولاً، أكد الباحثون أن تغيير جين في خلية كبدية تسبب في تغيير سلوك تلك الخلية تحديداً، وهي ظاهرة تُعرف بالاستجابة الذاتية للخلية (cell-autonomous response). فعلى سبيل المثال، عندما عطلوا جيناً مسؤولاً عن طي البروتين، أظهرت الخلايا الكبدية المتأثرة استجابة إجهاد واضحة، حيث قامت بتفعيل جينات للتعامل مع الضرر مع إيقاف جينات متعلقة بوظائف الكبد الطبيعية. كانت هذه التغييرات محصورة في الخلايا المعدلة، بينما ظلت الخلايا المجاورة غير متأثرة. وهذا أكد أن الطريقة الجديدة يمكنها بدقة رصد العواقب المباشرة للاضطرابات الجينية داخل البيئة المعقدة لعضو حي.

والأمر الأكثر إثارة للدهشة هو أن الباحثين وجدوا أن تغيير جين واحد في خلية كبدية يمكن أن يحفز أيضاً تغييرات في الخلايا المحيطة بها مباشرة، وهي ظاهرة تُسمى الاستجابة غير الذاتية للخلية (cell non-autonomous response). فقد أدى التعديل الجيني في خلية واحدة إلى إرسال إشارات أعادت تشكيل الحي المجاوز. وفي مثال صارخ، عندما عطلوا جيناً يسمى Vhl في الخلايا الكبدية، بدأت تلك الخلايا تتصرف كما لو كانت في بيئة منخفضة الأكسجين. أدى هذا التغيير إلى سلسلة من التأثيرات في الخلايا القريبة؛ حيث بدأت خلايا الأوعية الدموية وخلايا الدعم الموجودة بجوار الخلايا الكبدية المعدلة في التعبير عن جينات مرتبطة ببناء أوعية دموية جديدة وتنشيط برامج النمو الخاصة بها. كانت هذه التغييرات في أقوى حالاتها في الخلايا الأقرب إلى الخلية الكبدية المعدلة، وتلاشت مع زيادة المسافة، مما أظهر تدرجاً واضحاً للتأثير يشع من المصدر.

وفي اكتشاف آخر، وجد الفريق أن تعطيل جين متعلق بمضخة خلوية تسمى V-ATPase أدى إلى تراكم موضعي لنوع معين من الخلايا المناعية. فعندما تعرضت الخلايا الكبدية لخلل في وظيفة V-ATPase، تجمع عدد كبير من نوع من الخلايا المناعية التي تشبه الخلايا التغصنية التابعة للخلايا اللمفاوية (plasmacytoid dendritic cell) بجوارها مباشرة. لم يُلاحظ هذا التراكم مع التغييرات الجينية الأخرى، مما يشير إلى وجود رابط محدد بين فشل هذه المضخة الخلوية واستدعاء هذه الخلايا المناعية. لاحظ الباحثون أن هذه الخلايا المناعية كانت متمركزة ضمن مسافة قصيرة جداً من الخلايا الكبدية المعدلة، مشكلةً عنقوداً متميزاً لم يكن موجوداً في الأنسجة السليمة المحيطة.

تكمن قوة هذا النهج الجديد في قدرته على الربط بين التغيير الجيني، ورد فعل الخلية نفسه، ورد فعل جيرانها، كل ذلك مع الحفاظ على الترتيب الفيزيائي للنسيج. ومن خلال رسم خرائط لهذه التفاعلات في عضو حي، أظهر الباحثون أن الاضطرابات الجينية لا تحدث في فراغ؛ بل تمتد آثارها للخارج، لتغير تكوين وسلوك المجتمع الخلوي المحلي. توفر هذه الدراسة طريقة مبسطة وقابلة للتوسع للتحقيق في كيفية قيام الخلايا المعدلة جينياً بإعادة تشكيل بيئاتها الدقيقة، مما يفتح نافذة جديدة على الحياة الاجتماعية المعقدة للخلايا داخل نسيج سليم. وتفتح هذه الطريقة الباب لفهم كيف يمكن للأمراض أن تنتشر أو تُحتوى داخل عضو ما، وكيف يؤثر الترتيب الفيزيائي للخلايا على وظيفتها، دون الحاجة إلى تفكيك النسيج.