MERFISH-based pooled genetic screening reveals cell non-autonomous phenotypes in intact tissue

Le cellule non vivono isolate. Anche all'interno di un singolo organo, esse esistono in un quartiere affollato e strutturato dove la loro posizione, la loro forma e la costante comunicazione con i vicini ne determinano il comportamento. Per decenni, gli scienziati sono stati in grado di studiare come la modifica di un singolo gene influenzi una cellula, ma farlo in modo da preservare l'orientamento originale della cellula e la sua relazione con il tessuto circostante è stato un ostacolo importante. I metodi tradizionali richiedono l'estrazione delle cellule dal corpo, la loro scomposizione e la lettura del loro codice genetico in una provetta. Questo processo distrugge la mappa di dove si trovava la cellula e chi fossero i suoi vicini. Per comprendere veramente come un cambiamento genetico si propaghi attraverso un tessuto vivente, i ricercatori avevano bisogno di un modo per guardare all'interno dell'organo intatto, identificare quali cellule fossero state alterate e vedere come tali cambiamenti influenzassero le cellule immediatamente adiacenti, il tutto senza perdere il contesto spaziale.

Un team di ricercatori dell'Università di Harvard e dell'Howard Hughes Medical Institute ha sviluppato una nuova tecnica di imaging che risolve questo problema. Hanno creato un metodo per eseguire screening genetici su larga scala direttamente all'interno del tessuto epatico intatto di un topo. Utilizzando un sistema di imaging ad alta risoluzione chiamato MERFISH, sono stati in grado di tracciare l'identità genetica delle singole cellule, misurare il loro stato molecolare interno e mappare la loro esatta posizione rispetto ai vicini. L'innovazione chiave è stata un modo per leggere i "codici a barre" genetici che identificano quali cellule siano state alterate, senza utilizzare complessi passaggi chimici per amplificare il segnale. Questa semplificazione ha permesso loro di rilevare molti più marcatori genetici e messaggi cellulari rispetto ai metodi precedenti, consentendo di profilare 1,5 milioni di cellule in un singolo esperimento. Il risultato è una mappa tridimensionale dettagliata che mostra non solo come una cellula modificata cambi se stessa, ma anche come essa rimodelli l'intero ambiente locale circostante.

I ricercatori hanno iniziato perfezionando i loro strumenti per farli lavorare senza la necessità di amplificazione enzimatica, un processo chimico spesso usato per potenziare i segnali deboli nell'imaging. Nel loro lavoro precedente, dovevano usare enzimi per moltiplicare i codici a barre genetici attaccati alle cellule che volevano studiare, ma questo aggiungeva passaggi che talvolta riducevano la chiarezza dei dati. Hanno scoperto che progettando codici a barre genetici più corti e compatti e facendo affidamento sull'abbondanza naturale di queste molecole all'interno della cellula, potevano rilevarli direttamente attraverso una semplice ibridazione. Questo approccio diretto si è rivelato significativamente più efficiente. Ha recuperato quasi dieci volte più codici a barre genetici e due volte e mezza più messaggi cellulari per cellula rispetto al loro vecchio metodo. Questo miglioramento ha significato che potevano assegnare con fiducia un'identità genetica a molte più cellule e vedere cambiamenti sottili nell'attività genica che prima erano invisibili.

Con questo sistema migliorato in mano, il team si è concentrato sul fegato di topo, un organo complesso composto da molti diversi tipi di cellule che lavorano insieme. Hanno introdotto una libreria di istruzioni genetiche nei fegati di topi giovani, prendendo di mira circa 200 geni specifici nelle cellule epatiche note come epatociti. Ogni cellula epatica ha ricevuto un codice a barre genetico unico che fungeva da etichetta, permettendo ai ricercatori di sapere esattamente quale gene fosse stato alterato in quella specifica cellula. Dopo che i topi sono cresciuti e i cambiamenti genetici hanno avuto effetto, i ricercatori hanno affettato il tessuto epatico e utilizzato il loro sistema di imaging per scansionare l'intero organo. Hanno identificato l'identità genetica di ogni cellula, misurato l'attività di centinaia di geni al suo interno e registrato la sua posizione precisa nel tessuto. In totale, hanno analizzato più di 1,5 milioni di cellule, creando un enorme dataset che collegava i cambiamenti genetici agli stati cellulari e alle posizioni spaziali.

Lo studio ha rivelato due distinti tipi di effetti. In primo luogo, i ricercatori hanno confermato che l'alterazione di un gene in una cella epatica causava il cambiamento del comportamento della cellula stessa, un fenomeno noto come risposta cellulo-autonoma. Ad esempio, quando hanno interrotto un gene coinvolto nel ripiegamento proteico, le cellule epatiche colpite mostravano una chiara risposta allo stress, attivando i geni per gestire il danno mentre disattivavano i geni relativi alle loro normali funzioni epatiche. Questi cambiamenti erano confinati alle cellule alterate, con le cellule vicine che rimanevano inalterate. Ciò ha confermato che il nuovo metodo poteva catturare accuratamente le conseguenze dirette delle perturbazioni genetiche all'interno del complesso ambiente di un organo vivente.

Più sorprendentemente, i ricercatori hanno scoperto che cambiare un singolo gene in una cellula epatica poteva anche innescare cambiamenti nelle cellule immediatamente circostanti, un fenomeno chiamato risposta cellulo-non-autonoma. L'alterazione genetica in una cellula inviava segnali che rimodellavano il quartiere locale. In un esempio sorprendente, quando hanno interrotto un gene chiamato Vhl nelle cellule epatiche, quelle cellule hanno iniziato ad agire come se si trovassero in un ambiente a basso contenuto di ossigeno. Questo cambiamento ha innescato una cascata di effetti nelle cellule vicine. Le cellule dei vasi sanguigni e le cellule di supporto proprio accanto alle cellule epatiche alterate hanno iniziato a esprimere geni associati alla costruzione di nuovi vasi sanguigni e all'attivazione dei propri programmi di crescita. Questi cambiamenti erano più forti nelle cellule più vicine alla cellula epatica alterata e sfumavano con l'aumentare della distanza, mostrando un chiaro gradiente di influenza che irradiava dalla fonte.

In un'altra scoperta, il team ha scoperto che la distruzione di un gene coinvolto in una pompa cellulare chiamata V-ATPase portava a un accumulo localizzato di un tipo specifico di cellula immunitaria. Quando le cellule epatiche presentavano una funzione V-ATPase compromessa, un tipo di cellula immunitaria simile a una cellula dendritica plasmocitoide si accumulava in grandi numeri proprio accanto a esse. Questo accumulo non è stato osservato con altri cambiamenti genetici, suggerendo un legame specifico tra il fallimento di questa pompa cellulare e il reclutamento di queste cellule immunitarie. I ricercatori hanno osservato che queste cellule immunitarie erano concentrate entro una distanza molto breve dalle cellule epatiche alterate, formando un cluster distinto che non era presente nel tessuto sano circostante.

La forza di questo nuovo approccio risiede nella sua capacità di collegare i punti tra un cambiamento genetico, la reazione della cellula stessa e la reazione dei suoi vicini, il tutto preservando la disposizione fisica del tessuto. Mappando queste interazioni in un organo vivente, i ricercatori hanno dimostrato che le perturbazioni genetiche non avvengono nel vuoto; esse si propagano verso l'esterno, alterando la composizione e il comportamento della comunità cellulare locale. Lo studio fornisce un modo semplificato e scalabile per investigare come le cellule geneticamente alterate rimodellino i loro microambienti, offrendo una nuova finestra sulla complessa vita sociale delle cellule all'interno di un tessuto intatto. Questo metodo apre la porta alla comprensione di come le malattie possano diffondersi o essere contenute all'interno di un organo, e di come la disposizione fisica delle cellule influenzi la loro funzione, senza la necessità di scomporre il tessuto.