MERFISH-based pooled genetic screening reveals cell non-autonomous phenotypes in intact tissue
यह अध्ययन एक प्रवर्धन-मुक्त (amplification-free) MERFISH-आधारित पूल्ड स्क्रीनिंग पद्धति प्रस्तुत करता है जो अक्षुण्ण ऊतकों में आनुवंशिक विक्षोभों और अंतर्जात RNAs के पता लगाने की क्षमता को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ाता है, जिससे एक आनुवंशिक मोज़ेक माउस लिवर मॉडल में लाखों कोशिकाओं में सेल-ऑटोनॉमस और सेल नॉन-ऑटोनॉमस दोनों फेनोटाइपिक प्रतिक्रियाओं के व्यवस्थित मानचित्रण को सक्षम बनाया जा सके।
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कोशिकाएं अलगाव में नहीं रहती हैं। एक ही अंग के भीतर भी, वे एक भीड़भाड़ वाले, संरचित पड़ोस में मौजूद होती हैं जहाँ उनकी स्थिति, आकार और पड़ोसियों के साथ निरंतर संचार उनके व्यवहार को आकार देता है। दशकों तक, वैज्ञानिक यह अध्ययन करने में सक्षम रहे हैं कि कैसे एक एकल जीन में परिवर्तन एक कोशिका को प्रभावित करता है, लेकिन ऐसा करने का तरीका जो कोशिका के मूल स्थान और आसपास के ऊतकों के साथ उसके संबंध को सुरक्षित रखे, एक बड़ी बाधा रहा है। पारंपरिक तरीकों के लिए कोशिकाओं को शरीर से बाहर निकालने, उन्हें तोड़ने और एक टेस्ट ट्यूब में उनके आनुवंशिक कोड को पढ़ने की आवश्यकता होती है। यह प्रक्रिया इस मानचित्र को नष्ट कर देती है कि कोशिका कहाँ थी और उसके पड़ोसी कौन थे। यह वास्तव में समझने के लिए कि एक आनुवंशिक परिवर्तन जीवित ऊतक के भीतर कैसे लहरें पैदा करता है, शोधकर्ताओं को एक ऐसे तरीके की आवश्यकता थी जिससे वे एक अखंड अंग के भीतर देख सकें, यह पहचान सकें कि किन कोशिकाओं को बदला गया था, और यह देख सकें कि उन परिवर्तनों ने ठीक बगल वाली कोशिकाओं को कैसे प्रभावित किया, वह भी स्थानिक संदर्भ (spatial context) को खोए बिना।
हार्वर्ड यूनिवर्सिटी और हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट के शोधकर्ताओं की एक टीम ने एक नई इमेजिंग तकनीक विकसित की है जो इस समस्या का समाधान करती है। उन्होंने सीधे साबुत माउस लिवर (यकृत) ऊतक के भीतर बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीनिंग करने का एक तरीका बनाया है। एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग सिस्टम, जिसे MERFISH कहा जाता है, का उपयोग करके, वे व्यक्तिगत कोशिकाओं की आनुवंशिक पहचान को ट्रैक करने, उनकी आंतरिक आणविक अवस्था को मापने और पड़ोसियों के सापेक्ष उनके सटीक स्थान को मैप करने में सक्षम थे। मुख्य नवाचार उन आनुवंशिक "बारकोड" को पढ़ने का एक तरीका था जो यह पहचानते हैं कि किन कोशिकाओं को बदला गया है, बिना सिग्नल को बढ़ाने के लिए जटिल रासायनिक चरणों का उपयोग किए। इस सरलीकरण ने उन्हें पिछले तरीकों की तुलना में बहुत अधिक आनुवंशिक मार्कर और कोशिकीय संदेशों का पता लगाने में सक्षम बनाया, जिससे वे एक ही प्रयोग में 1.5 मिलियन कोशिकाओं का प्रोफाइल तैयार कर सके। परिणाम एक विस्तृत, त्रि-आयामी मानचित्र है जो न केवल यह दिखाता है कि एक संशोधित कोशिका स्वयं को कैसे बदलती है, बल्कि यह भी कि वह अपने आस-पास के संपूर्ण स्थानीय वातावरण को कैसे नया आकार देती है।
शोधकर्ताओं ने अपने उपकरणों को एंजाइमेटिक प्रवर्धन (enzymatic amplification) की आवश्यकता के बिना काम करने के लिए परिष्कृत करना शुरू किया, जो इमेजिंग में कमजोर संकेतों को बढ़ाने के लिए अक्सर उपयोग की जाने वाली एक रासायनिक प्रक्रिया है। उनके पिछले काम में, उन्हें उन आनुवंशिक बारकोड को बढ़ाने के लिए एंजाइमों का उपयोग करना पड़ता था जो उनके द्वारा अध्ययन की जाने वाली कोशिकाओं से जुड़े होते थे, लेकिन इस प्रक्रिया ने ऐसे चरण जोड़ दिए थे जो कभी-कभी डेटा की स्पष्टता को कम कर देते थे। उन्होंने पाया कि छोटे, अधिक सघन आनुवंशिक बारकोड डिजाइन करके और कोशिका के भीतर इन अणुओं की प्राकृतिक प्रचुरता पर भरोसा करके, वे सरल संकरण (hybridization) के माध्यम से उन्हें सीधे पहचान सकते थे। यह प्रत्यक्ष दृष्टिकोण काफी अधिक कुशल साबित हुआ। इसने उनके पुराने तरीके की तुलना में लगभग दस गुना अधिक आनुवंशिक बारकोड और प्रति कोशिका ढाई गुना अधिक कोशिकीय संदेशों को पुनः प्राप्त किया। इस सुधार का अर्थ था कि वे बहुत अधिक कोशिकाओं को आनुवंशिक पहचान आत्मविश्वास के साथ दे सकते थे और जीन गतिविधि में उन सूक्ष्म परिवर्तनों को देख सकते थे जो पहले अदृश्य थे।
इस बेहतर प्रणाली के साथ, टीम ने माउस लिवर की ओर रुख किया, जो कई अलग-अलग प्रकार की कोशिकाओं से बना एक जटिल अंग है जो मिलकर काम करती हैं। उन्होंने युवा चूहों के लिवर में आनुवंशिक निर्देशों की एक लाइब्रेरी पेश की, जो लिवर कोशिकाओं (हेपेटोसाइट्स) के लगभग 200 विशिष्ट जीनों को लक्षित करती थी। प्रत्येक लिवर कोशिका को एक अद्वितीय आनुवंशिक बारकोड प्राप्त हुआ जो एक लेबल के रूप में कार्य करता था, जिससे शोधकर्ता यह जान सके कि उस विशिष्ट कोशिका में किस जीन को बदला गया था। जब चूहे बढ़े और आनुवंशिक परिवर्तन प्रभावी हुए, तो शोधकर्ताओं ने लिवर ऊतक को स्लाइस किया और पूरे अंग को स्कैन करने के लिए अपने इमेजिंग सिस्टम का उपयोग किया। उन्होंने प्रत्येक कोशिका की आनुवंशिक पहचान की पहचान की, उसके भीतर सैकड़ों जीनों की गतिविधि को मापा, और ऊतक में उसकी सटीक स्थिति दर्ज की। कुल मिलाकर, उन्होंने 1.5 मिलियन से अधिक कोशिकाओं का विश्लेषण किया, जिससे एक विशाल डेटासेट बना जिसने आनुवंशिक परिवर्तनों को कोशिकीय अवस्थाओं और स्थानिक स्थानों से जोड़ दिया।
अध्ययन ने दो अलग प्रकार के प्रभावों का खुलासा किया। पहला, शोधकर्ताओं ने पुष्टि की कि एक लिवर कोशिका में जीन को बदलने से उस विशिष्ट कोशिका के व्यवहार में परिवर्तन होता है, जिसे सेल-ऑटोनॉमस रिस्पॉन्स (cell-autonomous response) कहा जाता है। उदाहरण के लिए, जब उन्होंने प्रोटीन फोल्डिंग में शामिल एक जीन को बाधित किया, तो प्रभावित लिवर कोशिकाओं ने एक स्पष्ट तनाव प्रतिक्रिया दिखाई, जिसमें उन्होंने सामान्य लिवर कार्यों से संबंधित जीनों को बंद करते हुए क्षति से निपटने के लिए जीनों को चालू कर दिया। ये परिवर्तन परिवर्तित कोशिकाओं तक ही सीमित थे, जबकि पड़ोसी कोशिकाएं अप्रभावित रहीं। इसने पुष्टि की कि नया तरीका एक जीवित अंग के जटिल वातावरण के भीतर प्रत्यक्ष आनुवंशिक व्यवधानों (genetic perturbations) को सटीक रूप से पकड़ सकता है।
अधिक आश्चर्यजनक रूप से, शोधकर्ताओं ने पाया कि लिवर कोशिका में एक एकल जीन को बदलने से उसके ठीक आसपास की कोशिकाओं में भी परिवर्तन शुरू हो सकता है, जिसे सेल नॉन-ऑटोनॉमस रिस्पॉन्स (cell non-autonomous response) कहा जाता है। एक कोशिका में आनुवंशिक परिवर्तन ने संकेतों को भेजा जिसने स्थानीय पड़ोस को नया आकार दिया। एक उल्लेखनीय उदाहरण में, जब उन्होंने लिवर कोशिकाओं में Vhl नामक जीन को बाधित किया, तो वे कोशिकाएं इस तरह व्यवहार करने लगीं जैसे वे कम-ऑक्सीजन वाले वातावरण में हों। इस परिवर्तन ने पास की कोशिकाओं में प्रभावों की एक श्रृंखला शुरू कर दी। परिवर्तित लिवर कोशिकाओं के ठीक बगल में स्थित रक्त वाहिका कोशिकाओं और सहायक कोशिकाओं ने नई रक्त वाहिकाओं के निर्माण और अपनी स्वयं की वृद्धि कार्यक्रमों को सक्रिय करने से जुड़े जीन व्यक्त करना शुरू कर दिया। ये परिवर्तन परिवर्तित लिवर कोशिका के सबसे करीब की कोशिकाओं में सबसे मजबूत थे और जैसे-जैसे दूरी बढ़ी, वे कम होते गए, जो स्रोत से निकलने वाले प्रभाव के एक स्पष्ट ग्रेडिएंट (gradient) को दर्शाते हैं।
एक अन्य खोज में, टीम ने पाया कि V-ATPase नामक कोशिकीय पंप से जुड़े जीन को बाधित करने से एक विशिष्ट प्रकार की प्रतिरक्षा कोशिका का स्थानीय संचय हुआ। जब लिवर कोशिकाओं में V-ATPase का कार्य बाधित हुआ, तो एक प्रकार की प्रतिरक्षा कोशिका जो प्लास्मासाइटॉइड डेंड्रिटिक सेल (plasmacytoid dendritic cell) के समान थी, उनके ठीक बगल में उच्च संख्या में जमा होने लगी। यह संचय अन्य आनुवंशिक परिवर्तनों के साथ नहीं देखा गया, जो इस कोशिकीय पंप की विफलता और इन प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती के बीच एक विशिष्ट संबंध का सुझाव देता है। शोधकर्ताओं ने देखा कि ये प्रतिरक्षा कोशिकाएं परिवर्तित लिवर कोशिकाओं के बहुत कम दूरी के भीतर केंद्रित थीं, जो एक विशिष्ट क्लस्टर बनाती थीं जो आसपास के स्वस्थ ऊतक में मौजूद नहीं था।
इस नए दृष्टिकोण की शक्ति एक आनुवंशिक परिवर्तन, कोशिका की अपनी प्रतिक्रिया और उसके पड़ोसियों की प्रतिक्रिया के बीच के कड़ियों को जोड़ने की इसकी क्षमता में निहित है, और वह भी ऊतक के भौतिक लेआउट को सुरक्षित रखते हुए। एक जीवित अंग में इन अंतःक्रियाओं को मैप करके, शोधकर्ताओं ने दिखाया कि आनुवंशिक व्यवधान केवल शून्य में नहीं होते हैं; वे बाहर की ओर लहरों की तरह फैलते हैं, जिससे स्थानीय कोशिकीय समुदाय की संरचना और व्यवहार बदल जाता है। यह अध्ययन यह दिखाने का एक सरल और स्केलेबल तरीका प्रदान करता है कि कैसे आनुवंशिक रूप से परिवर्तित कोशिकाएं अपने सूक्ष्म वातावरण (microenvironments) को नया आकार देती हैं, जो एक अखंड ऊतक के भीतर कोशिकाओं के जटिल सामाजिक जीवन को समझने के लिए एक नया द्वार खोलता है। यह विधि यह समझने का अवसर प्रदान करती है कि बीमारियाँ एक अंग के भीतर कैसे फैल सकती हैं या कैसे नियंत्रित हो सकती हैं, और कैसे कोशिकाओं की भौतिक व्यवस्था उनके कार्य को प्रभावित करती है, वह भी ऊतक को तोड़ने की आवश्यकता के बिना।
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