MERFISH-based pooled genetic screening reveals cell non-autonomous phenotypes in intact tissue

細胞は孤立して生きているわけではありません。単一の臓器内であっても、細胞は密集し構造化された「近所付き合い」の中に存在しており、その位置や形、そして隣接する細胞との絶え間ないコミュニケーションが、彼らの振る舞いを決定づけています。数十年にわたり、科学者たちは一つの遺伝子の変化がいかに細胞に影響を与えるかを研究してきましたが、細胞本来の場所や周囲の組織との関係性を維持したままこれを行うことには大きな困難が伴いました。伝統的な手法では、細胞を体外に取り出し、バラバラの状態にしてから試験管の中で遺伝暗号を読み取る必要があります。このプロセスによって、細胞がどこにいたのか、誰が隣人であったかという地図（空間的コンテキスト）は破壊されてしまいます。遺伝的な変化が生きている組織の中にどのように波及していくのかを真に理解するためには、損傷のない状態の器官の内部を観察し、どの細胞が変化したのかを特定し、それらの変化がすぐ隣の細胞にどのような影響を与えたのかを、空間情報を失うことなく見る方法が必要でした。

ハーバード大学とハワード・ヒューズ医学研究所の研究チームは、この問題を解決する新しいイメージング技術を開発しました。彼らは、マウスの完全な肝臓組織内で大規模な遺伝子スクリーニングを実行できる手法を作り出したのです。高解像度のイメージングシステムであるMERFISHを用いることで、個々の細胞の遺伝的アイデンティティを追跡し、内部の分子状態を測定し、隣接する細胞に対する正確な位置をマッピングすることに成功しました。ここでの鍵となる革新は、複雑な化学的工程を用いてシグナルを増幅させることなく、どの細胞が改変されたかを識別するための遺伝的「バーコード」を読み取れるようにした点です。この簡略化により、従来のメソッドよりもはるかに多くの遺伝マーカーや細胞内のメッセージを検出できるようになり、一度の実験で150万個もの細胞をプロファイリングすることが可能になりました。その結果、修正された細胞自体がどのように変化するかだけでなく、それが周囲の局所的な環境をいかに作り変えるかを示す詳細な三次元マップが得られました。

研究者たちはまず、画像の信号を強めるためにしばしば用いられる酵素による増幅（エンザイマティック・アンプリフィケーション）を用いずに動作するようにツールを改良することから始めました。以前の研究では、調査対象の細胞に付着した遺伝的バーコードを倍増させるために酵素を使用する必要がありましたが、これはデータの明瞭さを低下させるステップを追加していました。彼らは、より短くコンパクトな遺伝的バーコードを設計し、細胞内に存在するこれらの分子の自然な豊富さに頼ることにより、単純なハイブリダイゼーションを通じて直接検出できることを発見しました。この直接的なアプローチは、極めて効率的であることが証明されました。これにより、従来の手法と比較して、約10倍多くの遺伝的バーコードと、2.5倍多くの細胞内メッセージを回収することができました。この改善により、より多くの細胞に対して自信を持って遺伝的アイデンティティを割り当てることができ、以前は見ることができなかった微細な遺伝活動の変化をも捉えられるようになりました。

この改良されたシステムを手に、チームは多種多様な細胞タイプが協力して働く複雑な臓器であるマウスの肝臓へと取り組みました。彼らは若いマウスの肝臓に対し、肝細胞として知られるヘパトサイトを標的にして、約200種類の特定の遺伝子に関する遺伝指令ライブラリを導入しました。各肝細胞にはユニークな遺伝的バーコードが付与され、これがラベルとして機能することで、研究者はその特定の細胞においてどの遺伝子が改変されたのかを正確に把握することができました。マウスが成長し、遺伝的変化が定着した後、研究者たちは肝臓の組織をスライスし、イメージングシステムを使用して器官全体をスキャンしました。彼らは各細胞の遺伝的アイデンティティを特定し、その中の数百もの遺伝子の活性を測定し、組織における精密な位置を記録しました。合計で150万個以上の細胞を分析し、遺伝的変化を細胞の状態および空間的位置に関連付けた膨大なデータセットを作成しました。

この研究により、2つの異なるタイプの効果が明らかになりました。第一に、研究者たちは、肝細胞における遺伝子の改変がその細胞自身の振る舞いに変化を引き起こすことを確認しました。これは「細胞自律的応答（cell-autonomous response）」と呼ばれる現象です。例えば、タンパク質の折り畳みに関与する遺伝子を阻害した場合、影響を受けた肝細胞は明確なストレス反応を示し、正常な肝機能を担う遺伝子をオフにする一方で、ダメージに対処するための遺伝子をオンにしました。これらの変化は改変された細胞内に限定されており、隣接する細胞には影響を与いませんでした。これにより、本手法が、生きた臓器内の複雑な環境下においても、遺伝子的摂動の直接的な帰結を正確に捕捉できることが裏付けられました。

さらに驚くべきことに、研究者たちは、肝細胞における単一の遺伝子の変化が、直近の周囲にある細胞にも変化を引き起こす可能性があることも発見しました。これは「非自律的細胞応答（cell non-autonomous response）」と呼ばれる現象です。ある細胞における遺伝的改変は、局所の近所にいる細胞たちの姿を造り変えるような信号を送りました。顕著な例の一つとして、「Vhl」と呼ばれる遺伝子を肝細胞で破壊すると、それらの細胞は低酸素環境にいるかのように振る舞い始めました。この変化は連鎖反応を引き起こし、改変された肝細胞のすぐそばにある血管細胞や支持細胞が、新しい血管を構築したり独自の成長プログラムを起動させたりする関連遺伝子を発現し始めたのです。これらの変化は、改変された肝細胞に最も近い細胞で最も強く、距離が増すにつれて減衰していきました。これは、発生源から放射状に広がる影響の明白な勾配を示しています。

別の発見として、チームは細胞ポンプであるV-ATPaseに関わる遺伝子を阻害すると、特定の種類の免疫細胞が集積することを突き止めました。肝細胞のV-ATPase機能が損なわれると、プラスモイドサイトカイン樹状細胞に似た型の免疫細胞が高密度に集まりました。この蓄積は他の遺伝的変化では見られなかったため、この細胞ポンプの不全と免疫細胞の動員との間に特異的な関連があることが示唆されました。研究者たちは、これらの免疫細胞が改変された肝細胞のごく短い距離内に集中していることを観察しましたが、それは周辺の健康な組織には存在しない独特のクラスターを形成していました。

この新しいアプローチの力は、物理的な組織レイアウトを保持しながら、遺伝的変化、細胞自身の反応、そして隣人の反応の間にある「点のつながり」を結びつける能力にあります。生きた器官におけるこうした相互作用をマッピングすることで、研究者たちは、遺伝的摂動が真空中で起きるのではなく、外部へ向かって波紋のように広がり、局所的な細胞コミュニティの構成と振る舞いを変えていく様子を描き出しました。この研究は、遺伝的に改変された細胞がいかにしてマイクロエンバイロメント（微小環境）を再編するかを調査するための、簡素化されスケールアップ可能な方法を提供しており、疾患がどのように臓器内で広がったり抑制されたりするのか、また細胞の物理的な配置がいかに機能に影響を与えるのかを理解するための新たな窓を開いています。しかも、それを組織を壊すことなく行うことができるのです。