MERFISH-based pooled genetic screening reveals cell non-autonomous phenotypes in intact tissue

Zellen leben nicht isoliert. Selbst innerhalb eines einzelnen Organs existieren sie in einer dicht gedrängten, strukturierten Nachbarschaft, in der ihre Position, Form und die ständige Kommunikation mit ihren Nachbarn ihr Verhalten prägen. Jahrzehntelang waren Wissenschaftler in der Lage zu untersuchen, wie die Veränderung eines einzelnen Gens eine Zelle beeinflusst, aber dies auf eine Weise zu tun, die die ursprüngliche Lage der Zelle und ihre Beziehung zum umliegenden Gewebe bewahrt, war eine große Hürde. Traditionelle Methoden erfordern das Herauslösen von Zellen aus dem Körper, deren Zerlegung und das Ablesen ihres genetischen Codes in einem Reagenzglas. Dieser Prozess zerstört die Karte dessen, wo die Zelle war und wer ihre Nachbarn waren. Um wirklich zu verstehen, wie sich eine genetische Veränderung durch ein lebendes Gewebe zieht, mussten Forscher einen Weg finden, in das intakte Organ hineinzuschauen, zu identifizieren, welche Zellen verändert worden waren, und zu sehen, wie diese Veränderungen die Zellen direkt neben ihnen beeinflussten, ohne den räumlichen Kontext zu verlieren.

Ein Team von Forschern der Harvard University und des Howard Hughes Medical Institute hat eine neue Bildgebungstechnik entwickelt, die dieses Problem löst. Sie entwickelten eine Methode, um groß angelegte genetische Screens direkt in intaktem Mauslebergewebe durchzuführen. Durch die Verwendung eines hochauflösenden Bildgebungssystems namens MERFISH konnten sie die genetische Identität einzelner Zellen verfolgen, ihren internen molekularen Zustand messen und ihren exakten Standort relativ zu den Nachbarn kartieren. Die entscheidende Innovation war eine Möglichkeit, die genetischen „Barcodes“ zu lesen, die identifizieren, welche Zellen verändert wurden, ohne komplexe chemische Schritte zur Signalverstärkung anzuwenden. Diese Vereinfachung ermöglichte es ihnen, weitaig mehr genetische Marker und zelluläre Botschaften als bisherige Methoden zu detektieren, was die Profilierung von 1,5 Millionen Zellen in einem einzigen Experiment ermöglichte. Das Ergebnis ist eine detaillierte, dreidimensionale Karte, die nicht nur zeigt, wie eine modifizierte Zelle sich selbst verändert, sondern auch, wie sie das gesamte lokale Umfeld um sich herum umgestaltet.

Die Forscher begannen damit, ihre Werkzeuge zu verfeinern, um ohne die Notwendigkeit einer enzymatischen Amplifikation zu arbeiten – ein chemischer Prozess, der oft verwendet wird, um schwache Signale in der Bildgebung zu verstär-stärken. In ihrer bisherigen Arbeit mussten sie Enzyme verwenden, um die an die Zellen gebundenen genetischen Barcodes zu vervielfältigen, die sie untersuchen wollten, aber dies fügte Schritte hinzu, die manchmal die Klarheit der Daten reduzierten. Sie entdeckten, dass sie, indem sie kürzere, kompaktere genetische Barcodes entwarfen und sich auf die natürliche Abundanz dieser Moleküle innerhalb der Zelle verließen, diese direkt durch einfache Hybridisierung detektieren konnten. Dieser direkte Ansatz erwies sich als signifikant effizienter. Er stellte fast zehnmal so viele genetische Barcodes und zweieinhalbmal so viele zelluläre Botschaften pro Zelle wieder her wie ihre ältere Methode. Diese Verbesserung bedeutete, dass sie wesentlich mehr Zellen eine genetische Identität zuweisen und subtile Veränderungen der Genaktivität sehen konnten, die zuvor unsichtbar waren.

Mit diesem verbesserten System in der Hand wandte sich das Team der Mausleber zu, einem komplexen Organ, das aus vielen verschiedenen Zelltypen besteht, die zusammenarbeiten. Sie führten eine Bibliothek genetischer Anweisungen in die Lebern junger Mäuse ein, wobei sie etwa 200 spezifische Gene in Leberzellen, den Hepatozyten, ansteuerten. Jede Leberzelle erhielt einen einzigartigen genetischen Barcode, der als Etikett diente, sodass die Forscher genau wissen konnten, welches Gen in dieser spezifischen Zelle verändert worden war. Nachdem die Mäuse gewachsen waren und die genetischen Veränderungen Wirkung zeigten, schnitt das Team das Lebergewebe in Scheiben und nutzte ihr Bildgebungssystem, um das gesamte Organ zu scannen. Sie identifizierten die genetische Identität jeder Zelle, maßen die Aktivität hunderter Gene innerhalb dieser und zeichneten ihre präzise Position im Gewebe auf. Insgesamt analysierten sie mehr als 1,5 Millionen Zellen und erstellten einen massiven Datensatz, der genetische Veränderungen mit zellulären Zuständen und räumlichen Lokalisationen verknüpfte.

Die Studie offenbarte zwei unterschiedliche Arten von Effekten. Erstens bestätigten die Forscher, dass die Veränderung eines Gens in einer Leberzelle dazu führte, dass diese spezifische Zelle ihr eigenes Verhalten änderte, ein Phänomen, das als zellautonome Reaktion bekannt ist. Wenn sie beispielsweise ein Gen störten, das an der Proteinfaltung beteiligt ist, zeigten die betroffenen Leberzellen eine klare Stressreaktion, indem sie Gene zur Bewältigung des Schadens aktivierten, während sie Gene bezüglich ihrer normalen Leberfunktionen abschalteten. Diese Veränderungen waren auf die veränderten Zellen beschränkt, während die benachbarten Zellen unbeeinflusst blieben. Dies bestätigte, dass die neue Methode in der Lage war, die direkten Folgen genetischer Perturbationen innerhalb der komplexen Umgebung eines lebenden Organs präzise zu erfassen.

Noch überraschender fanden die Forscher heraus, dass die Veränderung eines einzelnen Gens in einer Leberzelle auch Veränderungen in den unmittelbar umgebenden Zellen auslösen konnte, ein Phänomen, das als zellnicht-autonome Reaktion bezeichnet wird. Die genetische Veränderung in einer Zelle sandte Signale aus, die die lokale Nachbarschaft umgestalteten. In einem markanten Beispiel: Als sie ein Gen namens Vhl in Leberzellen störten, begannen diese Zellen so zu agieren, als befänden sie sich in einer sauerstoffarmen Umgebung. Diese Veränderung löste eine Kaskade von Effekten in den nahegelegenen Zellen aus. Die Blutgefäßzellen und Stützzellen direkt neben den veränderten Leberzellen begannen, Gene zu exprimieren, die mit dem Aufbau neuer Blutgefäße und der Aktivierung ihrer eigenen Wachstumsprogramme assoziiert sind. Diese Veränderungen waren in den Zellen am stärksten, die sich am nächsten an der veränderten Leberzelle befanden, und nahmen mit zunehmender Entfernung ab, was einen klaren Einflussgradienten zeigte, der vom Ursprung ausstrahlte.

Bei einer weiteren Entdeckung stellte das Team fest, dass die Störung eines Gens, das an einer zellulären Pumpe namens V-ATPase beteiligt ist, zu einer lokalisierten Akkumulation eines spezifischen Typs von Immunzellen führte. Wenn Leberzellen eine beeinträchtigte V-ATPase-Funktion aufwiesen, sammelten sich in hoher Zahl Immunzellen, die einer plasmacytoiden dendritischen Zelle ähnelten, direkt neben ihnen an. Diese Akkumulation wurde bei anderen genetischen Veränderungen nicht beobachtet, was auf eine spezifische Verbindung zwischen dem Versagen dieser zellulären Pumpe und der Rekrutierung dieser Immunzellen hindeutete. Die Forscher beobachteten, dass diese Immunzellen in einer sehr kurzen Distanz zu den veränderten Leberzellen konzentriert waren und einen distinkten Cluster bildeten, der im umliegenden gesunden Gewebe nicht vorhanden war.

Die Stärke dieses neuen Ansatzes liegt in seiner Fähigkeit, die Punkte zwischen einer genetischen Veränderung, der Reaktion der Zelle selbst und der Reaktion ihrer Nachbarn zu verbinden, während gleichzeitig das physische Layout des Gewebes bewahrt wird. Durch die Kartierung dieser Interaktionen in einem lebenden Organ zeigten die Forscher, dass genetische Perturbationen nicht einfach im Vakuum stattfinden; sie breiten sich nach außen aus und verändern die Zusammensetzung und das Verhalten der lokalen zellulären Gemeinschaft. Die Studie bietet einen vereinfachten und skalierbaren Weg, um zu untersuchen, wie genetisch veränderte Zellen ihre Mikroumgebungen umgestalten, und eröffnet damit ein neues Fenster in das komplexe soziale Leben der Zellen innerhalb eines intakten Gewebes. Diese Methode öffnet die Tür dazu, zu verstehen, wie Krankheiten sich innerhalb eines Organs ausbreiten oder darin eingegrenzt werden können und wie die physische Anordnung von Zellen deren Funktion beeinflusst, ohne das Gewebe zerlegen zu müssen.