MERFISH-based pooled genetic screening reveals cell non-autonomous phenotypes in intact tissue

Cellen leven niet in isolatie. Zelfs binnen een enkel orgaan bestaan ze in een drukke, gestructureerde buurt waar hun positie, vorm en constante communicatie met buren hun gedrag bepalen. Decennialang waren wetenschappers in staat om te bestuderen hoe het veranderen van een enkel gen een cel beïnvloedt, maar dit doen op een manier die de oorspronkelijke locatie van de cel en de relatie tot het omliggende weefsel behoudt, is een grote hindernis geweest. Traditionele methoden vereisen dat cellen uit het lichaam worden gehaald, uit elkaar worden gehaald en hun genetische code in een reageerbuis worden afgelezen. Dit proces vernietigt de kaart van waar de cel zich bevond en wie zijn buren waren. Om echt te begrijpen hoe een genetische verandering door een levend weefsel rimpelt, hadden onderzoekers een manier nodig om in het intacte orgaan te kijken, te identificeren welke cellen waren aangepast, en te zien hoe die veranderingen de cellen direct naast hen beïnvloedden, en dat alles zonder de ruimtelijke context te verliezen.

Een team onderzoekers aan de Harvard University en de Howard Hughes Medical Institute heeft een nieuwe beeldvormingstechniek ontwikkeld die dit probleem oplost. Ze hebben een methode ontwikkeld om grootschalige genetische screens direct in intact leverweefsel van muizen uit te voeren. Door gebruik te maken van een hoogwaardig beeldvormingssysteem genaamd MERFISH, waren zij in staat om de genetische identiteit van individuele cellen te volgen, hun interne moleculaire staat te meten en hun exacte locatie ten opzichte van buren in kaart te brengen. De belangrijkste innovatie was een manier om de genetische "barcodes" te lezen die identificeren welke cellen waren aangepast, zonder complexe chemische stappen te gebruiken om het signaal te versterken. Deze vereenvoudiging stelde hen in staat om veel meer genetische markers en cellulaire boodschappen te detecteren dan eerdere methoden, wat hen in staat stelde om 1,5 miljoen cellen in één enkel experiment te profileren. Het resultaat is een gedetailleerde, driedimensionale kaart die niet alleen laat zien hoe een gemodificeerde cel zichzelf verandert, maar ook hoe deze de gehele lokale omgeving om zich heen hervormt.

De onderzoekers begonnen hun instrumenten te verfijnen om te kunnen werken zonder de noodzaak van enzymatische amplificatie, een chemisch proces dat vaak wordt gebruikt om zwakke signalen in beeldvorming te versterken. In hun eerdere werk moesten ze enzymen gebruiken om de genetische barcodes die aan de cellen die ze wilden bestuderen waren bevestigd te vermenigvuldigen, maar dit voegde stappen toe die soms de helderheid van de gegevens verminderden. Ze ontdekten dat door kortere, compactere genetische barcodes te ontwerpen en te vertrouwen op de natuurlijke overvloed van deze moleculen binnen de cel, ze deze direct konden detecteren via eenvoudige hybridisatie. Deze directe aanpak bleek aanzienlijk efficiënter. Het herstelde bijna tien keer zoveel genetische barcodes en tweeënhalf keer zoveel cellulaire boodschappen per cel vergeleken met hun oudere methode. Deze verbetering betekende dat ze met meer vertrouwen een genetische identiteit aan veel meer cellen konden toewijzen en subtiele veranderingen in genactiviteit konden zien die voorheen onzichtbaar waren.

Met dit verbeterde systeem in handen, richtte het team zich op de lever van de muis, een complex orgaan dat bestaat uit vele verschillende celtypen die samenwerken. Ze introduceerden een bibliotheek van genetische instructies in de levers van jonge muizen, waarbij ze ongeveer 200 specifieke genen in levercellen, ook wel hepatocyten genoemd, targetten. Elke levercel ontving een unieke genetische barcode die fungeerde als een label, waardoor de onderzoekers precies wisten welk gen in die specifieke cel was aangepast. Nadat de muizen groeiden en de genetische veranderingen effect kregen, sneden de onderzoekers het leverweefsel en gebruikten ze hun beeldvormingssysteem om het hele orgaan te scannen. Ze identificeerden de genetische identiteit van elke cel, maten de activiteit van honderden genen daarin, en legden de precieze positie in het weefsel vast. In totaal analyseerden ze meer dan 1,5 miljoen cellen, waarmee ze een enorme dataset creëerden die genetische veranderingen koppelde aan cellulaire staten en ruimtelijke locaties.

De studie onthulde twee verschillende soorten effecten. Ten eerste bevestigden de onderzoekers dat het aanpassen van een gen in een levercel ervoor zorgde dat die specifieke cel zijn eigen gedrag veranderde, een fenomeen dat bekend staat als een cel-autonoom respons. Bijvoorbeeld, wanneer ze een gen dat betrokken is bij eiwitvouwing verstoorden, vertoonden de aangetaste levercellen een duidelijke stressrespons, waarbij ze genen inschakelden om de schade aan te pakken terwijl ze genen gerelateerd aan hun normale leverfuncties uitschakelden. Deze veranderingen waren beperkt tot de aangetaste cellen, waarbij de naburige cellen onveranderd bleven. Dit bevestigde dat de nieuwe methode erin kon slagen de directe gevolgen van genetische perturbaties binnen de complexe omgeving van een levend orgaan nauwkeurig vast te leggen.

Nog verrassender was dat de onderzoekers ontdekten dat het veranderen van een enkel gen in een levercel ook veranderingen kon triggeren in de cellen die er direct omheen liggen, een fenomeen dat een cel niet-autonome respons wordt genoemd. De genetische aanpassing in één cel stuurde signalen die de lokale buurt hervormden. In één opvallend voorbeeld, toen ze een gen genaamd Vhl in levercellen verstoorden, begonnen die cellen te handelen alsof ze in een omgeving met weinig zuurstof waren. Deze verandering triggerde een cascade van effecten in de nabijgelegen cellen. De bloedvatcellen en ondersteunende cellen direct naast de aangetaste levercellen begonnen genen tot expressie te brengen die geassocieerd zijn met het bouwen van nieuwe bloedvaten en het activeren van hun eigen groeiprogramma's. Deze veranderingen waren het sterkst in de cellen die het dichtst bij de aangetaste levercel lagen en namen af naarmate de afstand toenam, wat een duidelijke gradiënt van invloed liet zien die vanuit de bron uitstraalde.

Bij een andere ontdekking merkte het team dat het verstoren van een gen dat betrokken is bij een cellulaire pomp genaamd V-ATPase leidde tot een gelokaliseerde accumulatie van een specifiek type immuuncel. Wanneer levercellen een beperkte V-ATPase-functie hadden, verzamelde een type immuuncel dat lijkt op een plasmacytoïde dendritische cel zich in grote aantallen direct naast hen. Deze accumulatie werd niet gezien bij andere genetische veranderingen, wat wijst op een specifieke link tussen het falen van deze cellulaire pomp en de rekrutering van deze immuuncellen. De onderzoekers observeerden dat deze immuuncellen geconcentreerd waren binnen een zeer korte afstand van de aangetaste levercellen, waarbij ze een duidelijk cluster vormden dat niet aanwezig was in het omliggende gezonde weefsel.

De kracht van deze nieuwe aanpak ligt in het vermogen om de verbanden te leggen tussen een genetische verandering, de reactie van de cel zelf, en de reactie van zijn buren, terwijl de fysieke lay-out van het weefsel behouden blijft. Door deze interacties in een levend orgaan in kaart te brengen, lieten de onderzoekers zien dat genetische perturbaties niet in een vacuüm plaatsvinden; ze rimpelen naar buiten en veranderen de samenstelling en het gedrag van de lokale cellulaire gemeenschap. De studie biedt een vereenvoudigde en schaalbare manier om te onderzoeken hoe genetisch aangetaste cellen hun micro-omgevingen hervormen, wat een nieuw venster biedt op het complexe sociale leven van cellen binnen een intact weefsel. Deze methode opent de deur naar het begrijpen van hoe ziekten zich binnen een orgaan kunnen verspreiden of juist kunnen worden ingeperkt, en hoe de fysieke rangschikking van cellen hun functie beïnvloedt, zonder dat het weefsel uit elkaar hoeft te worden gehaald.