Sample preparation optimisation for array tomography volume EM of entire organisms: a case study for marine larvae
تعمل هذه الدراسة على تحسين سير عمل تحضير العينات بالتجميد عالي الضغط من أجل التصوير المجهري الإلكتروني الحجمي بأسلوب التخطيط المصفوفي ليرقات الدودة الحلقية البحرية *Platynereis dumerilii*، وذلك عبر التقييم المنهجي لطرق التثبيت والصبغ بواسطة التصوير بالأشعة السينية السينكروترونية والمجهر الإلكتروني الماسح لتأسيس بروتوكول قوي قابل للتكيف مع الكائنات البحرية العالقة المماثلة.
البحث الأصلي مرخَّص بموجب CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). هذا شرح مولَّده بالذكاء الاصطناعي لبحث مسبق لم يخضع لمراجعة الأقران. وهو ليس نصيحة طبية. لا تتخذ أي قرارات تتعلق بصحتك بناءً على هذا المحتوى. اقرأ إخلاء المسؤولية الكامل
لرؤية البنية الخفية للحياة، يلجأ العلماء غالباً إلى المجهر الإلكتروني، وهي تقنية تستخدم حزمًا من الإلكترونات بدلاً من الضوء للكشف عن الآليات المعقدة داخل الخلايا. وبينما يمكن للمجاهر القياسية إظهار شريحة واحدة من نسيج ما، يتيح المجهر الإلكتروني الحجمي للباحثين إعادة بناء مناظر طبيعية ثلاثية الأبعاد بالكامل، وتتبع كيفية اتصال آلاف الخلايا لتشكيل كائن حي وظيفي. ويعد هذا الأمر صعباً بشكل خاص عند دراسة الكائنات الصغيرة الرقيقة مثل اليرقات البحرية، التي لا يتجاوز طولها غالباً بضع مئات من الميكرومترات وتكون مغلفة بطبقات واقية تقاوم المعالجات الكيميائية القياسية. فإذا كانت عملية التحضير قاسية للغاية، تنهار الهياكل الداخلية الرقيقة أو تتشقق؛ وإذا كانت لطيفة للغاية، تفتقر الصورة إلى التباين اللازم للتمييز بين عضية وأخرى. والهدف هو تجميد لحظة حية بشكل مثالي بحيث تكشف الصورة الناتجة عن البيولوجيا الحقيقية للكائن دون تشويه، وهو تحدٍ حدّ طويلاً من قدرتنا على رسم المخططات السلكية الكاملة لحيوانات كاملة.
لقد طور فريق من الباحثين في جامعة هايدلبرغ، بالتعاون مع زملاء من جميع أنحاء أوروبا، طريقة منقحة لالتقاط هذه الحيوانات البحرية الصغيرة بدقة عالية. فقد ركزوا على يرقات دودة Platynereis dumerilii، وهي دودة بحرية تعمل كنموذج رئيسي لفهم تطور الحيوان. هذه اليرقات صغيرة، حيث يتراوح طولها بين 200 و350 ميكرومتر، وتحتوي على حوالي 10,000 خلية. هدف الباحثون إلى إنشاء سير عمل موثوق يمكنه الحفاظ على الكائن بأكمله سليماً، مما يسمح لهم بتقسيمه إلى طبقات رقيقة جداً وتصوير كل منها لبناء نموذج ثلاثي الأبعاد كامل. ولتحقيق ذلك، اختبروا مجموعة متنوعة من تقنيات التجميد والتلوين، مستخدمين تصوير الأشعة السينية القوي لفحص مئات العينات قبل الالتزام بالعملية المستهلكة للوقت المتمثلة في القطع والمسح باستخدام المجهر الإلكتروني.
بدأت العملية بالتجميد عالي الضغط، وهي تقنية تعمل على تجميد الماء داخل الخلايا فورياً دون تكوين بلورات ثلجية ضارة، مما يؤدي فعلياً إلى إيقاف بيولوجيا الحيوان في حالة قريبة من حالته الطبيعية. ومع ذلك، وجد الباحثون أن مجرد تجميد اليرقات لم يكن كافياً؛ إذ أحدثت الطريقة التي تم التعامل بها معها خلال الخطوات اللاحقة فرقاً حاسماً. فقد اكتشفوا أن وضع الكثير من اليرقات معاً في حاوية واحدة تسبب في ازدحامها، مما جعل من المستحيل رؤية التفاصيل الفردية في فحوصات الأشعة السينية. وعلى العكس من ذلك، فإن تجميدها في مجموعات مكونة من 10 إلى 15 يرقة وفر التوازن المثالي، مما سمح للفريق بتحديد وعزل العينات السليمة. كما وجدوا أيضاً أن استخدام حاملات مطلية بالذهب بدلاً من تلك المصنوعة من الألمنيوم منع التفاعلات الكيميائية التي قد تعكر الصورة، وأن إبقاء اليرقات داخل أوعية متخصصة أثناء عملية التجميد، بدلاً من نقلها بين الأنابيب، قلل من خطر فقدان هذه العينات الصغيرة الهشة.
بمجرد تجميد اليرقات، كان على الفريق استبدال الجليد براتنج بلاستيكي صلب يحافظ على الهيكل متماسكاً لأجل القطع. وقد اختبروا عدة وصفات مختلفة لعملية "الاستبدال بالتجميد" هذه، حيث قاموا بتغيير المواد الكيميائية المستخدمة لتلوين الأنسجة ودرجة الحرارة التي تحدث عندها التغييرات. استخدمت بعض الطرق معادن ثقيلة لتعتيم أغشية الخلايا، بينما اعتمدت طرق أخرى على مثبتات كيميائية يتم تطبيقها قبل التجميد. استخدم الباحثون تصوير الأشعة السينية من السينكروترون ليعمل كفحص مسبق، للتحقق من التباين وسلامة كل عينة قبل قطعها. كانت هذه الخطوة حيوية، لأنها سمحت لهم باستبعاد العينات التي ظهرت بها شقوق أو افتقرت إلى التلوين الكافي، مما وفر شهوراً من العمل الذي كان سيضيع سدى على عينات تالفة. ووجدوا أن حوالي 30 إلى 40 بالمائة من العينات التي تمت معالجتها بطرقهم المحسنة كانت سليمة بما يكفي لاستخدامها في إعادة البناء ثلاثي الأبعاد الكامل.
تضمنت المرحلة النهائية تقطيع اليرقات المغلفة بالراتنج إلى شرائط من المقاطع، طول كل منها 50 نانومتر فقط، وتصويرها باستخدام مجهر إلكتروني ماسح. قارن الفريق النتائج من بروتوكولاتهم المختلفة لمعرفة أي منها يحافظ على أدق التفاصيل. ووجدوا أنه بينما أنتجت بعض الطرق صوراً ذات تباين عالٍ، إلا أنها أدت أحياناً إلى حجب الأنسجة الدقيقة لأغشية الخلايا. وكانت الطريقة الأكثر نجاحاً هي التي جمعت بين التجميد عالي الضغط وبروتوكول تلوين محدد يستخدم مزيجاً من المعادن الثقيلة والتحكم الدقيق في درجة الحرارة. حافظت هذه الطريقة على الهياكل الدقيقة للأهداب، والنوى، والعضيات الأخرى بوضوح ملحوظ. ومن المثير للاهتمام، وجدوا أيضاً أن تجفيف المقاطع المقطوعة عند درجة حرارة منخفضة تبلغ 37 درجة مئوية منعها من الالتواء أو التشقق، وهو تعديل بسيط حسن جودة الصور النهائية بشكل كبير.
تؤكد الدراسة أن التجميد يتفوق على التثبيت الكيميائي بالنسبة لهذه الكائنات البحرية الصغيرة، والذي غالباً ما يترك وراءه آثاراً مثل الأغشية المجعدة أو النوى التالفة. ومن خلال تحسين خطوات التعامل والتلوين، أنشأ الباحثون سير عمل قوياً يمكن تطبيقه على يرقات بحرية مماثلة، بما في ذلك يرقات الديدان المفلطحة والقشريات. يفتح هذا التقدم الباب لرسم المخططات العصبية الكاملة لحيوانات بأكملها، وهي مهمة كانت صعبة للغاية سابقاً بسبب هشاشة العينات. إن القدرة على رؤية هذه الكائنات الصغيرة بهذه الدقة العالية دون إتلاف بنيتها الداخلية توفر نافذة أوضح على كيفية بناء الأنظمة البيولوجية المعقدة، مما يقدم معياراً جديداً لدراسة العالم المجهري للحياة البحرية.
غارق في أبحاث مجالك؟
تصلك نشرة يومية بأحدث الأبحاث المطابقة لكلماتك البحثية المفتاحية — مع ملخصات تقنية، بلغتك.