Sample preparation optimisation for array tomography volume EM of entire organisms: a case study for marine larvae
本研究は、海洋性環形動物である*Platynereis dumerilii*の幼生を対象としたアレイ・トモグラフィー・ボリューム電子顕微鏡観察に向けて、シンクロトロンX線撮像および走査電子顕微鏡を用いた固定法と染色法の系統的な評価を通じて高圧凍結試料作製ワークフローを最適化し、同様の海洋性プランクトン生物に適応可能な堅牢なプロトコルを確立するものである。
原論文は CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) でライセンスされています。 これは査読を受けていないプレプリントのAI生成解説です。医学的助言ではありません。この内容に基づいて健康上の判断をしないでください。 免責事項の全文を読む
生命の隠された構造を明らかにするために、科学者たちはしばしば電子顕微鏡へと目を向けます。これは、光の代わりに電子ビームを用いることで、細胞内部の複雑な機構を明らかにする技術です。標準的な顕微鏡は組織の単一の断面を示すことができますが、ボリューム電子顕微鏡（volume electron microscopy）を用いれば、研究者は完全な三次元の景観を再構築し、数千もの細胞がいかにして繋がり、機能的な生物体を形成しているかを辿ることができます。これは、海洋の幼生のような、わずか数百マイクロメートルほどの長さしかなく、標準的な化学処理に耐性を持つ保護層に包まれた、極めて小さく繊ள்ளதுな生物を研究する場合、特に困難を極めます。もし準備が過酷すぎれば、繊細な内部構造が崩壊または亀裂が生じ、逆に緩やかすぎれば、画像は細胞小器官を識別するために必要なコントラストを欠いてしまいます。目標は、生きている瞬間を完璧に凍結させ、その結果得られる画像が、歪みなく生物の真の生物学を明らかにすることですが、これは長らく、動物全体の完全な配線図を描く能力を制限してきた課題でした。
ハイデルベルク大学の研究チームは、ヨーロッパ全域の共同研究者と共に、これらの小さな海洋生物を高精細に捉える洗練された手法を開発しました。彼らは、動物の進化を理解するための重要なモデルである海洋虫、プラティネレイス・ドゥメルリィ（Platynereis dumerilii）の幼生に焦点を当てました。これらの幼生は小さく、長さは200から350マイクロメートルの範囲で、約10,000個の細胞を含んでいます。研究者たちは、生物体全体を損なうことなく保存し、それを極めて薄い層にスライスして各層を撮影することで、完全な3Dモデルを構築できる信頼性の高いワークフローを作成することを目指しました。これを達成するために、彼らは強力なX線イメージングを用いて、時間を要する切断や電子顕微鏡によるスキャニングを行う前に、数百もの検体をスクリーニングしながら、さまざまな凍結および染色技術をテストしました。
プロセスは高圧凍結から始まりました。これは、細胞内の水を瞬時に固化させることで、損傷を与える氷結晶の形成を防ぎ、生物学的な状態をほぼ自然に近い状態で停止させる技術です。しかし、研究者たちは、単に幼生を凍結させるだけでは不十分であることを発見しました。その後の工程における取り扱い方法が決定的な違いを生むのです。彼らは、一度にあまりに多くの幼生を一つの容器に入れると、それらが密集してしまい、X線スキャンで個々の詳細を確認することが不可能になることを発見しました。逆に、10個から15個のグループとして凍結することで、チームは健全な検体を特定し、分離するという完璧なバランスを得ることができました。また、アルミニウム製ではなく金コーティングされたキャリアを使用することで、画像を曇らせる化学反応を防げることや、幼生をチューブ間で移動させるのではなく、凍結プロセス中に専用のバケットの中に保持しておくことが、これら小さく脆弱な試料を紛失するリスクを最小限に抑えられることも分かりました。
幼生が凍結された後、チームは氷を硬いプラスチック樹脂に置き換え、その樹脂が切断時の構造を保持できるようにしなければなりませんでした。彼らは、組織を染色するために使用する化学物質や、変化が起こる温度を変えながら、この「凍結置換（freeze-substitution）」プロセスにおけるいくつかの異なるレシピをテストしました。ある手法では重金属を使用して細胞膜を暗くし、別の手法では凍結前に適用される化学的固定剤に依存していました。研究者たちは、シンクロトロン放射光を用いたX線イメージリングを事前スクリーニングとして利用し、切断を行う前に各サンプルのコントラストと完全性をチェックしました。このステップは極めて重要でした。なぜなら、亀裂が生じたものや染色が不十分な検体を排除することができ、そうでなければ無駄になっていたはずの数ヶ月間の作業を節約できたからです。彼らは、最適化された手法で処理されたサンプルのうち、完全な3D再構築に使用できるほど健全なものは約30〜40パーセントであったことを見出しました。
最終段階では、樹脂に埋め込まれた幼生を、厚さわずか50ナノメートルのリボン状のセクションへとスライスし、走査電子顕微鏡で撮影しました。チームは、どのプロトコルが最も微細な詳細を保持しているかを確認するために、異なる手法による結果を比較しました。その結果、一部の手法は高いコントラストを生み出すものの、細胞膜の微細な質感を不明瞭にしてしまうことがあることが分かりました。最も成功したアプローチは、高圧凍結と、重金属の混合物と慎重な温度制御を用いた特定の染色プロトコルを組み合わせたものでした。この手法は、繊細な構造である繊毛、核、その他の細胞小器官を驚くほど鮮明に保存しました。興味深いことに、スライスされたセクションを37度というより低い温度で乾燥させることで、カールや亀裂を防げることも分かり、この単純な調整が最終的な画像の品質を大幅に向上させました。
この研究は、これらの小さな海洋生物にとって、凍結は化学的固定よりも優れていることを裏付けています。化学的固定は、膜のしわや核の損傷といったアーティファクト（人工的な偽像）を残すことがよくあります。取り扱いや染色工程を洗練させることで、研究者たちは、扁形動物や甲殻類を含む他の同様の海洋幼生にも適用できる堅牢なワークフローを作り上げました。この進歩は、検体の脆弱性のためにこれまで困難であった、動物全体の完全な神経接続をマッピングするという課題への扉を開きます。これらの小さな生物を、その内部構造を損なうことなくこれほど高い解像度で観察できる能力は、複雑な生物学的システムがいかに構築されているかを知るためのより明確な窓を提供し、海洋生物の微視的世界を研究するための新たな基準を示すものです。
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