Sample preparation optimisation for array tomography volume EM of entire organisms: a case study for marine larvae
본 연구는 유사한 해양 부유 생물들에게도 적용 가능한 견고한 프로토콜을 구축하기 위해, 싱크로트론 X선 이미징과 주사전자현미경(SEM)을 통해 고정 및 염색 방법을 체계적으로 평가함으로써 해양 다모류 *Platynereis dumerilii* 유충의 어레이 토모그래피 볼륨 전자현미경 관찰을 위한 고압 동결 시료 준비 워크플로우를 최적화한다.
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생명의 숨겨진 구조를 보기 위해 과학자들은 종종 전자 현미경을 활용하는데, 이는 빛 대신 전자의 빔을 사용하여 세포 내부의 복잡한 기계 장치를 밝혀내는 기술이다. 표준 현미경은 조직의 단일 단면만을 보여줄 수 있는 반면, 볼륨 전자 현미경은 연구자들이 전체 3차원 경관을 재구성하여 수천 개의 세포가 어떻게 연결되어 기능하는 유기체를 형성하는지 추적할 수 있게 해준다. 이는 특히 몇 백 마이크로미터 길이에 불과하며 표준적인 화학 처리에 저항하는 보호층에 둘러싸인 해양 유생과 같이 작고 섬세한 생물들을 연구할 때 매우 어렵다. 만약 준비 과정이 너무 가혹하면 섬세한 내부 구조가 붕괴하거나 균열이 생기고, 너무 완만하면 이미지의 대비가 부족하여 한 소기관을 다른 것과 구별할 수 없게 된다. 목표는 살아있는 순간을 매우 완벽하게 얼려, 결과물이 왜곡 없이 유기체의 진정한 생물학적 모습을 드러내도록 하는 것이며, 이는 전체 동물의 완전한 배선도를 그리는 능력을 오랫동안 제한해 온 과제였다.
하이델베르크 대학교의 연구팀은 유럽 전역의 동료들과 협력하여, 이 작은 해양 동물들을 고해상도로 포착할 수 있는 정교한 방법을 개발했다. 그들은 동물 진화의 핵심 모델로 쓰이는 해양 벌레인 *플라티네리스 두메릴리(Platynereis dumerilii)*의 유생에 집중했다. 이 유생들은 길이는 200에서 350 마이크로미터 사이로 작으며, 약 10,000개의 세포를 포함하고 있다. 연구진은 유기체 전체를 온전하게 보존하여 이를 극도로 얇은 층으로 자르고 각 층을 촬영함으로써 완전한 3D 모델을 구축할 수 있는 신뢰할로 워크플로우를 만드는 것을 목표로 했다. 이를 달성하기 위해 그들은 다양한 냉동 및 염색 기술을 테스트했으며, 시간을 많이 소요하는 절단 및 전자 현미경 스캐닝 과정을 거치기 전에 강력한 X선 이미징을 사용하여 수백 개의 표본을 사전 검사했다.
과정은 고압 냉동법으로 시작되었는데, 이는 세포 내부의 물을 손상을 주는 얼음 결정 없이 즉각적으로 고체화하여 생물의 상태를 거의 자연스러운 상태 그대로 멈추게 하는 기술이다. 그러나 연구진은 단순히 유생을 얼리는 것만으로는 충분하지 않다는 것을 발견했다. 이후 단계에서 유생을 다루는 방식이 결정적인 차이를 만들었다. 그들은 너무 많은 유생을 하나의 용기에 함께 넣으면 서로 밀집되어 X선 스캔에서 개별 세부 사항을 보는 것이 불가능해진다는 것을 발견했다. 반대로, 10개에서 15개씩 묶어 얼리는 것은 팀이 건강한 표본을 찾아내고 격리할 수 있는 완벽한 균형을 제공했다. 또한, 알루미늄 대신 금 코팅된 캐리어를 사용하는 것이 이미지를 흐리게 할 수 있는 화학 반응을 방지한다는 것을 알아냈으며, 유생을 튜브 사이로 옮기는 대신 특수 제작된 버킷 안에 넣어 두는 것이 이 작고 취약한 샘플을 잃어버릴 위험을 최소러주었다.
유생이 얼려진 후, 팀은 얼음을 단단한 플라스틱 수지로 교체하여 절단 시 구조를 유지하도록 해야 했다. 그들은 조직을 염색하는 데 사용되는 화학 물질과 변화가 일어나는 온도를 달리하며 이 '동결 치환' 과정에 대한 여러 가지 레시피를 테스트했다. 어떤 방법은 무거운 금속을 사용하여 세포막을 어둡게 만들었고, 다른 방법은 얼리기 전에 적용되는 화학적 고정제를 사용했다. 연구진은 싱크로트론 X선 이미징을 사전 스크린으로 사용하여, 각 표본을 자르기 전에 대비와 무결성을 확인했다. 이 단계는 손상된 샘플에 낭비될 뻔한 수개월의 작업을 아끼기 위해 매우 중요했다. 그들은 최적화된 방법으로 처리된 샘로 중 약 30~40%가 완전한 3D 재구성에 사용할 수 있을 만큼 온전하다는 것을 발견했다.
마지막 단계는 수지에 박힌 유생을 각각 50 나노미터 두께의 리본 형태 섹션으로 얇게 썰어 주사 전자 현미경으로 촬영하는 과정이었다. 팀은 가장 미세한 세부 사항을 보존하는 것을 확인하기 위해 그들의 다양한 프로토콜 결과를 비교했다. 그들은 일부 방법이 높은 대비를 만들어내지만 때때로 세포막의 미세한 질감을 가린다는 것을 발견했다. 가장 성공적인 접근법은 고압 냉동과 무거운 금속 혼합물을 사용한 세심한 온도 제어가 포함된 특정 염색 프로토콜을 결리한 것이었다. 이 방법은 섬모, 핵 및 기타 소기관의 섬세한 구조를 놀라운 선명도로 보존했다. 흥론적이게도, 그들은 절단된 섹션을 37도라는 더 낮은 온도에서 건조하는 것이 섹션이 말리거나 갈라지는 것을 방지한다는 것을 발견했는데, 이는 최종 이미지의 품질을 크게 향상시킨 간단한 조정이었다.
이 연구는 이러한 작은 해양 생물들에게 있어, 화학적 고정이 종종 주름진 막이나 손상된 핵과 같은 인공물을 남기기 때문에 냉동법이 더 우수함을 확인해 준다. 냉동 처리와 염색 단계를 개선함으로써, 연구진은 편형동물이나 갑각류를 포함한 유사한 해양 유생들에게 적용할 수 있는 견고한 워크플로우를 구축했다. 이 발전은 이전에는 표본의 취약성 때문에 너무 어려웠던 작업인, 전체 동물의 완전한 신경 연결망을 지도화하는 문을 열어주었다. 이러한 작은 생물들을 내부 구조의 손상 없이 높은 해상도로 볼 수 있는 능력은 복잡한 생물학적 시스템이 어떻게 구축되는지에 대한 더 명확한 창을 제공하며, 해양 생물의 미시 세계를 연구하는 새로운 표준을 제시한다.
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