Sample preparation optimisation for array tomography volume EM of entire organisms: a case study for marine larvae
Deze studie optimaliseert een workflow voor monsterpreparatie met hogedrukbevriezing voor array-tomografie volumetrische EM van de larven van de mariene annelid *Platynereis dumerilii* door systematisch fixatie- en kleuringsmethoden te evalueren via synchrotoons röntgenbeeldvorming en SEM om een robuust protocol vast te stellen dat aanpasbaar is aan vergelijkbare mariene planktonische organismen.
Oorspronkelijk artikel gelicentieerd onder CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dit is een AI-gegenereerde uitleg van een preprint die niet peer-reviewed is. Dit is geen medisch advies. Neem geen gezondheidsbeslissingen op basis van deze inhoud. Lees de volledige disclaimer
Om de verborgen architectuur van het leven te zien, wenden wetenschappers zich vaak tot elektronenmicroscopie, een techniek die bundels elektronen gebruikt in plaats van licht om de ingewikkelde machinerie binnen cellen te onthullen. Terwijl standaard microscopen een enkele doorsnede van een weefsel kunnen tonen, maakt volumeelektronenmicroscopie het onderzoekers mogelijk om volledige driedimensionale landschappen te reconstrueren, waarbij ze traceren hoe duizenden cellen met elkaar verbonden zijn om een functionerende organisme te vormen. Dit is bijzonder moeilijk bij het bestuderen van kleine, delicate wezens zoals mariene larven, die vaak slechts enkele honderden micrometer lang zijn en gehuld zijn in beschermende lagen die weerstand bieden aan standaard chemische behandelingen. Als de voorbereiding te hardhandig is, storten de delicate interne structuren in of barsten ze; als het te zacht is, mist het beeld het contrast dat nodig is om het ene organel van het andere te onderscheiden. Het doel is om een levend moment zo perfect te bevriezen dat de resulterende afbeelding de ware biologie van het organisme onvervormd onthult, een uitdaging die ons vermogen om de volledige bedradingsdiagrammen van hele dieren langdurig heeft beperkt.
Een team van onderzoekers aan de Heidelberg Universiteit, werkend samen met collega's uit heel Europa, heeft nu een verfijnde methode ontwikkeld om deze kleine mariene dieren in hoge definitie vast te leggen. Ze richtten zich op de larven van Platynereis dumerilii, een mariene worm die dient als een belangrijk model voor het begrijpen van de evolutie van dieren. Deze larven zijn klein, variërend in lengte van 200 tot 350 micrometer, en bevatten ongeveer 10.000 cellen. De onderzoekers streefden ernaar om een betrouwbare workflow te creëren die de gehele organism intact kon bewaren, waardoor ze het in extreem dunne lagen konden snijden en elke laag konden fotograferen om een volledig 3D-model te bouwen. Om dit te bereiken, testten ze een verscheidenheid aan vries- en kleurtechnieken, waarbij ze krachtige röntgenbeeldvorming gebruikten om honderden specimens te screenen voordat ze zich vastlegden op het tijdrovende proces van snijden en scannen met een elektronenmicroscoop.
Het proces begon met hogedrukbevriezing, een techniek die water binnen de cellen onmiddellijk doet stollen zonder schadelijke ijskristallen te vormen, waardoor de biologie van het dier effectief wordt gepauzeerd in een bijna natuurlijke staat. De onderzoekers ontdekten echter dat het simpelweg bevriezen van de larven niet genoeg was; de manier waarop ze tijdens de daaropvolgende stappen werden gehanteerd, maakte een cruciaal verschil. Ze ontdekten dat het plaatsen van te veel larven in één enkele container ervoor zorgde dat ze te dicht op elkaar gepakt zaten, waardoor het onmogelijk werd om individuele details in de röntgenscans te zien. Omgekeerd bood het bevriezen in groepen van 10 tot 15 een perfecte balans, waardoor het team gezonde specimens kon lokaliseren en isoleren. Ze ontdekten ook dat het gebruik van gecoate dragers in plaats van aluminium exemplaren chemische reacties voorkwam die het beeld troebel konden maken, en dat het houden van de larven in gespecialiseerde bakjes tijdens het bevriezingsproces, in plaats van het verplaatsen tussen buisjes, het risico op het verliezen van deze kleine, fragiele monsters minimaliseerde.
Zodra de larven waren bevroren, moest het team het ijs vervangen door een harde kunststof hars die de structuur bij elkaar zou houden tijdens het snijden. Ze testten verschillende recepten voor dit "vries-substitutie"-proces, waarbij ze varieerden in de chemicaliën die werden gebruikt om het weefsel te kleuren en de temperatuur waarbij de veranderingen plaatsvonden. Sommige methoden gebruikten zware metalen om de celmembranen te verdonkeren, terwijl andere vertrouwden op chemische fixatie toegepast vóór het bevriezen. De onderzoekers gebruikten synchrotron röntgenbeeldvorming als een pre-screen, om de contrast en integriteit van elk monster te controleren voordat ze werden doorgesneden. Deze stap was essentieel, omdat het hen in staat stelde specimens die scheuren hadden ontwikkeld of onvoldoende kleuring hadden, te verwijderen, waardoor maanden aan werk die anders aan beschadigde monsters zou worden verspild, werden bespaard. Ze ontdekten dat ongeveer 30 tot 40 procent van de monsters die met hun geoptimaliseerde methoden waren verwerkt, intact genoeg waren voor volledige 3D-reconstructie.
De laatste fase bestond uit het snijden van de in hars ingebedde larven in linten van secties, elk slechts 50 nanometer dik, en het fotograferen ervan met een scanner elektronenmicroscoop. Het team vergeleek de resultaten van hun verschillende protocollen om te zien welke de fijnste details conserveerde. Ze ontdekten dat hoewel sommige methoden beelden met een hoog contrast produceerden, ze soms de fijne texturen van de celmembranen vertroebelden. De meest succesvolle aanpak combineerde hogedrukbevriezing met een specifiek kleurprotocol dat gebruikmaakte van een mengsel van zware metalen en zorgvuldige temperatuurcontrole. Deze methode behield de delicate structuren van de cilia, kernen en andere organellen met opmerkelijke helderheid. Interessant genoeg ontdekten ze ook dat het drogen van de gesneden secties bij een lagere temperatuur van 37 graden Celsius voorkwam dat ze krulden of barstten, een eenvoudige aanpassing die de kwaliteit van de uiteindelijke afbeeldingen aanzienlijk verbeterde.
De studie bevestigt dat voor deze kleine mariene organismen bevriezen superieur is aan chemische fixatie, wat vaak artefacten achterlaat zoals gerimpelde membranen of beschadigde kernen. Door de handling en kleuringsstappen te verfijnen, hebben de onderzoekers een robuuste workflow gecreëerd die kan worden toegepast op andere soortgelijke mariene larven, waaronder die van platwormen en kreeftachtigen. Deze vooruitgang opent de deur naar het in kaart brengen van de volledige neurale verbindingen van hele dieren, een taak die voorheen te moeilijk was vanwege de kwetsbaarheid van de specimens. Het vermogen om deze kleine wezens met een dergelijke hoge resolutie te zien zonder hun interne structuur te beschadigen, biedt een helderder venster op hoe complexe biologische systemen worden opgebouwd, en biedt een nieuwe standaard voor het bestuderen van de microscopische wereld van het mariene leven.
Verdrinkt u in papers in uw vakgebied?
Ontvang dagelijkse digests van de nieuwste papers die bij uw onderzoekswoorden passen — met technische samenvattingen, in uw taal.