Sample preparation optimisation for array tomography volume EM of entire organisms: a case study for marine larvae
本研究通过利用同步辐射 X 射线成像和扫描电子显微镜（SEM）系统地评估固定与染色方法，优化了用于海洋环节动物 *Platynereis dumerilii* 幼虫阵列断层扫描体积电子显微成像的高压冷冻样品制备工作流程，旨在建立一种可适用于类似海洋浮游生物的稳健方案。
原始论文采用 CC BY 4.0 许可（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。 这是一篇未经同行评审的预印本的AI生成解释。这不是医疗建议。请勿根据此内容做出健康决定。 阅读完整免责声明
为了窥见生命的隐藏架构，科学家们经常转向电子显微技术——这是一种利用电子束而非光束来揭示细胞内部复杂机制的技术。虽然标准显微镜可以展示组织的一个切片，但体积电子显微技术允许研究人员重建整个三维景观，追踪数以千计的细胞如何连接并形成一个功能完备的有机体。在研究像海洋幼虫这样微小且脆弱的生物时，这项工作尤为困难，因为它们通常只有几百微米长，并被一层抵抗标准化学处理的保护层所包裹。如果制备过程过于剧烈，精细的内部结构就会塌陷或破裂；如果过于温和，图像则缺乏区分不同细胞器的对比度。目标是如此完美地冻结生命瞬间，使所得图像能够展现生物真实的生物学特征而不产生畸变，这一挑战长期以来限制了我们绘制完整动物神经连接图谱的能力。
海德堡大学的一个研究团队与欧洲各地的同行合作，现已开发出一种精细的方法，能够高清晰度地捕捉这些微小的海洋动物。他们专注于研究Platynereis dumerilii（一种对理解动物进化至关重要的模式海洋蠕虫）的幼虫。这些幼虫体积很小，长度在200到350微米之间，包含大约10,000个细胞。研究人员旨在建立一套可靠的工作流程，能够完整地保存整个有机体，使其能够被切成极薄的层，并通过拍摄每一层来构建完整的3D模型。为了实现这一目标，他们测试了多种冷冻和染色技术，并在投入耗时的切割和扫描电子显微镜程序之前，使用强大的X射线成像技术对数百个标本进行筛选。
该过程始于高压冷冻技术，这种技术能使细胞内的水分瞬间凝固而不形成破坏性的冰晶，从而有效地将动物的生物状态停留在接近天然的状态。然而，研究人员发现，仅仅冷冻幼虫是不够的；在随后的步骤中处理它们的方式起到了关键作用。他们发现，将过多的幼虫放在同一个容器中会导致它们过于拥挤，从而无法在X射线扫描中看到单个细节。相反，将它们以10到15个为一组进行冷冻提供了完美的平衡，使团队能够定位并分离出健康的标本。他们还发现，使用镀金载体而非铝制载体可以防止可能导致图像模糊的化学反应，并且在冷冻过程中将幼虫保留在专门的小桶内，而不是在不同管子之间移动，可以最大限度地降低丢失这些微小且脆弱样本的风险。
幼虫冷冻后，团队必须用坚硬的塑料树脂取代冰，以支撑结构以便进行切割。他们测试了几种不同的“冷冻替代”配方，改变了用于组织染色的化学物质以及发生变化的温度。一些方法使用重金属使细胞膜变暗，而另一些方法则依赖于冷冻前应用的化学固定剂。研究人员利用同步辐射X射线成像作为预筛选，在切割之前检查每个样本的对比度和完整性。这一步骤至关重要，因为它允许他们丢弃那些已经产生裂纹或染色不足的标本，从而避免浪费数月的劳动。他们发现，在使用优化后的方法处理的样本中，大约有30%到40%的样本完整到可以用于完整的3D重建。
最后阶段涉及将嵌入树脂的幼虫切成带状的切片，每片仅50纳米厚，并使用扫描电子显微镜进行拍照。团队比较了不同方案的结果，以观察哪种方案能保留最精细的细节。他们发现，虽然某些方法产生的图像具有高对比度，但有时会掩盖细胞膜的精细纹理。最成功的方法是将高压冷冻与特定的染色方案相结合，该方案使用重金属混合物并配合精确的温度控制。这种方法以卓越的清晰度保留了纤毛、细胞核和其他细胞器的精细结构。有趣的是，他们还发现，在37摄氏度的较低温度下干燥切片可以防止其卷曲或破裂，这一简单的调整显著提高了最终图像的质量。
这项研究证实，对于这些小型海洋生物而言，冷冻优于化学固定，因为后者往往会留下如膜皱缩或细胞核受损等人工伪影。通过改进处理和染色步骤，研究人员创建了一套稳健的工作流程，可以应用于其他类似的海洋幼虫，包括扁形动物和甲壳类动物。这一进展为绘制完整动物的神经连接图谱打开了大门，而此前由于标本过于脆弱，这项任务一直难以实现。能够在不损坏其内部结构的情况下以如此高分辨率观察这些微小生物的能力，为观察复杂生物系统是如何构建的提供了一个更清晰的窗口，也为研究海洋生命的微观世界树立了新标准。
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