Sample preparation optimisation for array tomography volume EM of entire organisms: a case study for marine larvae
यह अध्ययन सिनक्रोट्रॉन एक्स-रे इमेजिंग और एसईएम (SEM) के माध्यम से स्थिरीकरण (fixation) और अभिरंजन (staining) विधियों का व्यवस्थित रूप से मूल्यांकन करके समुद्री एनेलिड *प्लैटिनेरिस डुमेरिली* (*Platynereis dumerilii*) के लार्वा के एरे टोमोग्राफी वॉल्यूम ईएम (EM) के लिए एक उच्च-दबाव फ्रीजिंग नमूना तैयारी वर्कफ़्लो को अनुकूलित करता है, ताकि समान समुद्री प्लवक जीवों के अनुकूल होने योग्य एक सुदृढ़ प्रोटोकॉल स्थापित किया जा सके।
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जीवन की छिपी हुई वास्तुकला को देखने के लिए, वैज्ञानिक अक्सर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की ओर मुड़ते हैं, जो एक ऐसी तकनीक है जो कोशिकाओं के भीतर की जटिल मशीनरी को प्रकट करने के लिए प्रकाश के बजाय इलेक्ट्रॉनों की बीमों का उपयोग करती है। जहाँ मानक सूक्ष्मदर्शी ऊतक के एक एकल स्लाइस को दिखा सकते हैं, वहीं वॉल्यूम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी शोधकर्ताओं को संपूर्ण तीन-आयामी परिदृश्यों के पुनर्निर्माण की अनुमति देती है, जिससे यह पता चलता है कि कैसे हजारों कोशिकाएं एक कार्यात्मक जीव बनाने के लिए आपस में जुड़ती हैं। यह विशेष रूप से समुद्री लार्वा जैसे छोटे, नाजुक जीवों का अध्ययन करते समय कठिन होता है, जो अक्सर केवल कुछ सौ माइक्रोमीटर लंबे होते हैं और सुरक्षात्मक परतों में लिपटे होते हैं जो मानक रासायनिक उपचारों का विरोध करती हैं। यदि तैयारी बहुत कठोर है, तो आंतरिक नाजुक संरचनाएं ढह जाती हैं या टूट जाती हैं; यदि यह बहुत कोमल है, तो छवि में एक अंगिका (ऑर्गेनेल) को दूसरी से अलग करने के लिए आवश्यक कंट्रास्ट (विभेद) की कमी होती है। लक्ष्य एक जीवित क्षण को इतनी पूर्णता से फ्रीज करना है कि परिणामी छवि विरूपण के बिना जीव के वास्तविक जीव विज्ञान को प्रकट करे, जो एक ऐसी चुनौती है जिसने लंबे समय से पूरे जानवरों के पूर्ण वायरिंग डायग्राम को मैप करने की हमारी क्षमता को सीमित किया है।
हाइडेलबर्ग विश्वविद्यालय के शोधकर्ताओं की एक टीम ने, यूरोप भर के सहयोगियों के साथ मिलकर, इन छोटे समुद्री जीवों को हाई डेफिनिशन में कैप्चर करने के लिए एक परिष्कृत विधि विकसित की है। उन्होंने प्लैटिनीरेज़ डुमेरिली (Platynereis dumerilii) के लार्वा पर ध्यान केंद्रित किया, जो पशु विकास को समझने के लिए एक प्रमुख मॉडल के रूप में कार्य करता है। ये लार्वा छोटे होते हैं, जिनकी लंबाई 200 से 350 माइक्रोमीटर के बीच होती है, और इनमें लगभग 10,000 कोशिकाएं होती हैं। शोधकर्ताओं का लक्ष्य एक विश्वसनीय वर्कफ़्लो बनाना था जो पूरे जीव को अक्षुण्ण रख सके, जिससे उन्हें इसे अत्यंत पतली परतों में काटने और प्रत्येक का फोटो खींचकर एक पूर्ण 3D मॉडल बनाने की अनुमति मिल सके। इसे प्राप्त करने के लिए, उन्होंने विभिन्न फ्रीजिंग और स्टेनिंग तकनीकों का परीक्षण किया, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ काटने और स्कैन करने की समय लेने वाली प्रक्रिया में प्रतिबद्ध होने से पहले सैकड़ों नमूनों की जांच करने के लिए शक्तिशाली एक्स-रे इमेजिंग का उपयोग किया।
प्रक्रिया की शुरुआत हाई-प्रेशर फ्रीजिंग से हुई, जो एक ऐसी तकनीक है जो कोशिकाओं के भीतर के पानी को हानिकारक बर्फ के क्रिस्टल बनाए बिना तुरंत ठोस बना देती है, जिससे जीव की जीव विज्ञान को लगभग मूल अवस्था में रोक दिया जाता है। हालांकि, शोधकर्ताओं ने पाया कि केवल लार्वा को फ्रीज करना पर्याप्त नहीं था; बाद के चरणों के दौरान उन्हें कैसे संभाला गया, इससे महत्वपूर्ण अंतर पड़ा। उन्होंने पाया कि एक ही कंटेनर में बहुत अधिक लार्वा रखने से वे भीड़भाड़ वाले हो जाते हैं, जिससे एक्स-रे स्कैन में व्यक्तिगत विवरण देखना असंभव हो जाता है। इसके विपरीत, उन्हें 10 से 15 के समूहों में फ्रीज करने से आदर्श संतुलन मिला, जिससे टीम को स्वस्थ नमूनों का पता लगाने और उन्हें अलग करने में मदद मिली। उन्होंने यह भी पाया कि एल्युमीनियम के बजाय गोल्ड-कोटिंग वाले कैरियर्स का उपयोग करने से उन रासायनिक प्रतिक्रियाओं को रोका जा सका जो छवि को धुंधला कर सकती थीं, और फ्रीजिंग प्रक्रिया के दौरान लार्वा को विशेष बकेट के अंदर रखने से, ट्यूबों के बीच इधर-उधर ले जाने के बजाय, इन छोटे, नाजुक नमूनों को खोने का जोखिम कम हो गया।
एक बार जब लार्वा फ्रीज हो गए, तो टीम को बर्फ को एक कठोर प्लास्टिक रेजिन से बदलना था जो काटने के लिए संरचना को थामे रखेगा। उन्होंने इस "फ्रीज-सब्सटिट्यूशन" प्रक्रिया के लिए कई अलग-अलग रेसिपी का परीक्षण किया, जिसमें ऊतकों को स्ट्रेन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले रसायनों और उस तापमान में भिन्नता की गई जिस पर परिवर्तन हुए। कुछ विधियों में सेल मेम्ब्रेन को गहरा करने के लिए भारी धातुओं का उपयोग किया गया, जबकि अन्य में फ्रीजिंग से पहले लगाए गए रासायनिक फिक्सेस का उपयोग किया गया। शोधकर्ताओं ने प्रत्येक नमूने के कंट्रास्ट और अखंडता की जांच करने के लिए सिनक्रोट्रॉन एक्स-रे इमेजिंग का उपयोग एक प्री-स्क्रीन के रूप में किया। यह चरण महत्वपूर्ण था, क्योंकि इसने उन्हें उन नमूनों को हटाने की अनुमति दी जिनमें दरारें आ गई थीं या जिनमें पर्याप्त स्टेनिंग की कमी थी, जिससे महीनों की मेहनत बर्बाद होने से बच गई जो क्षतिग्रस्त नमूनों पर व्यर्थ जाती। उन्होंने पाया कि उनके अनुकूलित तरीकों से संसाधित किए गए नमूनों में से लगभग 30 से 40 प्रतिशत पूर्ण 3D पुनर्निर्माण के लिए पर्याप्त अक्षुण्ण थे।
अंतिम चरण में रेजिन-एम्बेडेड लार्वा को रिबन जैसे खंडों में काटना शामिल था, जिनमें से प्रत्येक केवल 50 नैनोमीटर मोटा था, और उन्हें स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ फोटोग्राफ करना था। टीम ने यह देखने के लिए अपने विभिन्न प्रोटोकॉल के परिणामों की तुलना की कि कौन सा बारीक विवरणों को बेहतर ढंग से संरक्षित करता है। उन्होंने पाया कि जबकि कुछ विधियों ने उच्च कंट्रास्ट वाली छवियां बनाईं, वे कभी-कभी सेल मेम्ब्रेन की सूक्ष्म बनावट को धुंधला कर देती थीं। सबसे सफल दृष्टिकोण ने हाई-प्रेशर फ्रीजिंग को एक विशिष्ट स्टेनिंग प्रोटोकॉल के साथ जोड़ा जिसमें भारी धातुओं का मिश्रण और सावधानीपूर्वक तापमान नियंत्रण का उपयोग किया गया था। इस विधि ने सिलिया, न्यूक्लिआई और अन्य ऑर्गेनेल्स की नाजुक संरचनाओं को उल्लेखनीय स्पष्टता के साथ संरक्षित किया। दिलचस्प बात यह है कि उन्होंने पाया कि कटे हुए सेक्शन को 37 डिग्री सेल्सियस के निचले तापमान पर सुखाने से वे मुड़ने या टूटने से बच गए, जो एक सरल समायोजन था जिसने अंतिम छवियों की गुणवत्ता में काफी सुधार किया।
यह अध्ययन पुष्टि करता है कि इन छोटे समुद्री जीवों के लिए, केमिकल फिक्सेशन की तुलना में फ्रीजिंग बेहतर है, जो अक्सर झुर्रीदार झिल्ली या क्षतिग्रस्त न्यूक्लिआई जैसे आर्टिफैक्ट्स पीछे छोड़ देता है। हैंडलिंग और स्टेनिंग चरणों को परिष्कृत करके, शोधकर्ताओं ने एक मजबूत वर्कफ़्लो बनाया है जिसे अन्य समान समुद्री लार्वा, जैसे कि फ्लैटवॉर्म और क्रस्टेशियंस पर लागू किया जा सकता है। यह प्रगति पूरे जानवरों के पूर्ण तंत्रिका कनेक्शन (न्यूरल कनेक्शन) को मैप करने के द्वार खोलती है, जो कि नमूनों की नाजुकता के कारण पहले बहुत कठिन कार्य था। इन सूक्ष्म जीवों को बिना उनकी आंतरिक संरचना को नुकसान पहुँचाए इतने उच्च रिज़ॉल्यूशन में देखने की क्षमता, यह देखने के लिए एक स्पष्ट खिड़की प्रदान करती है कि जटिल जैविक प्रणालियाँ कैसे निर्मित होती हैं, जो समुद्री जीवन के सूक्ष्म जगत के अध्ययन के लिए एक नया मानक पेश करती है।
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