Facilitating the identification of cryo-EM hit matter in drug discovery with Astex-Faro

في رحلة البحث عن تصميم أدوية جديدة، يبدأ العلماء غالبًا بالعثور على جزيئات كيميائية صغيرة تلتصق ببروتين معين، تمامًا كما يجد المفتاح القفل المناسب. عادة ما تكون هذه الأجزاء صغيرة جدًا وترتبط بشكل ضعيف فقط، مما يجعل اكتشافها أمرًا صعبًا. ولرؤية هذه التفاعلات، يستخدم الباحثون تقنية تصوير قوية تسمى المجهر الإلكتروني بالتبريد (cryo-electron microscopy)، والتي تقوم بتجميد البروتينات في طبقة رقيقة من الجليد وتلتقط آلاف الصور لبناء نموذج ثلاثي الأبعاد. ومع ذلك، عندما يرتبط جزء من الدواء بعدد قليل فقط من جزيئات البروتين في العينة، فإن إشارته تضيع في الضجيج، فتظهر كبقعة باهتة وغير واضحة بدلاً من شكل محدد. وهذا يجعل من الصعب معرفة ما إذا كان مرشح الدواء قد نجح بالفعل أم أن الصورة هي مجرد نتيجة لتباين تجريبي.

لقد طور فريق من الباحثين طريقة جديدة تسمى "Astex-Faro" لحل هذه المشكلة المتمثلة في رصد الإشارات الضعيفة في مجال مزدحم. فبدلاً من النظر إلى صورة واحدة بمعزل عن غيرها، تقوم هذه الطريقة بمقارنة صورة جديدة مع مجموعة كبيرة من الصور المرجعية التي تم التقاطها لنفس البروتين عندما لا يكون مرتبطًا بأي دواء. ومن خلال تحليل الاختلافات بين الصورة الجديدة ومجموعة الصور المرجعية بأكملها، يمكن للنظام تحديد الأجزاء التي تختلف حقًا في البنية رياضياً. وهذا يسمح للبرمجيات بإبراز البقع الصغيرة والباهتة حيث قد يرتبط جزء من الدواء، حتى لو كان موجودًا في نسبة ضئيلة فقط من العينات. وقد اختبر الباحثون هذا النهج على ثلاثة بروتينات مختلفة، بما في ذلك أحد البروتينات التي تستقر داخل أغشية الخلايا، ووجدوا أنه يمكنه اكتشاف هذه التفاعلات الضعيفة بدقة وجعلها أكثر وضوحًا للعين البشرية.

يعتمد جوهر هذا النهج الجديد على إطار إحصائي يعامل مجموعة من صور البروتين ككتلة واحدة متسقة. وقبل البحث عن دواء، يقوم الباحثون أولاً بتحديد شكل البروتين عندما يكون فارغًا، أو ما يسمى بـ "apo"، من خلال جمع مجموعة من عمليات إعادة البناء المختلفة لنفس البروتين الفارغ. ولأن صورتين مجهريتين لا تتطابقان تمامًا بسبب الاختلافات الطبيعية في التجربة، احتاج الفريق إلى طريقة لقياس مدى اتساق هذه الصور مع بعضها البعض. لذا، قدموا مقياسًا جديدًا يطلقون عليه اسم "Fourier Shell Coherence" للتحقق مما إذا كانت مجموعة الصور تتفق على تفاصيل البنية وصولاً إلى مستوى معين من الحدة. وهذا يضمن أن أي اختلافات يتم العثัง عليها لاحقًا هي تغييرات حقيقية في البروتين وليست مجرد ضجيج عشوائي أو عدم اتساق في كيفية التقاط الصور.

بمجرد أن حدد الفريق هذا الخط المرجعي الموثوق لما يبدو عليه البروتين الفارغ، تمكنوا من اختباره مقابل صورة جديدة قد يتواجد فيها دواء. تقوم البرمجية بحساب درجة لكل نقطة صغيرة في النموذج ثلاثي الأبعاد، وتقيس مدى انحراف تلك النقطة عن متوسط مجموعة البروتين الفارغ. وإذا كانت النقطة مختلفة بشكل ملحوظ، يتم وضع علامة عليها كموقع ارتباط محتمل. وفي الاختبارات التي أجريت على بروتين يسمى "بيتا غالاكتوزيداز" (beta-galactosidase)، نجحت الطة في إبراز جزيء دواء، بل وأظهرت أيضًا كيف تتحرك أجزاء البروتين نفسها قليلاً لتستوعب الضيف الجديد. كما لاحظ الباحثون هذه التحركات في السلاسل الجانبية للبروتين، وهي الأذرع الصغيرة التي تساعد في تثبيت الدواء في مكانه، مما أكد أن التغييرات كانت ذات معنى بيولوجي وليست مجرد أخطاء عشوائية.

تتجلى قوة هذه الطريقة بشكل أكبر عند التعامل مع الأهداف الصعبة، مثل البروتينات المنغرسة في أغشية الخلايا. فهذه الهياكل بطبيعتها أكثر تعقيدًا وتغيرًا، مما يجعل من الصعب رؤية جزيئات الدواء الصغيرة. وعندما طبق الفريق طريقتهم على بروتين غشائي يسمى "TRPML1"، تمكنوا من العثور على دواء يرتبط بعمق داخل الغشاء، وهي منطقة عادة ما تكون مليئة بالضجيج ويصعب تفسيرها. ورغم أن إشارة الدواء كانت باهتة ومتقطعة، إلا أن التحليل الإحصائي حددها كتغيير جوهري عن البروتين الفارغ. كما كشفت الطريقة أن هيكل البروتين أعاد ترتيب نفسه حول الدواء، مما وفر صورة واضحة لكيفية حدوث التفاعل رغم البيئة الصعبة.

ولعل الميزة الأكثر قيمة لـ "Astex-Faro" هي قدرتها على استعادة الإشارات التي تكون ضعيفة للغاية لدرجة أنها قد تصبح غير مرئية في العادة. يحدث هذا عندما يرتبط الدواء بنسبة مئوية صغيرة فقط من البروتينات، وهو وضع يُعرف باسم "الارتباط الجزئي" (partial occupancy). في هذه الحالات، يتم تخفيف كثافة الدواء بواسطة العديد من البروتينات الفارغة، مما يؤدي إلى اختفائه في الخلفية. وقد أظهر الباحثون أن طريقتهم يمكنها حساب عامل وزن محدد لإزالة الإشارة "الفارغة" من الصورة رياضيًا. وعندما طبقوا هذا التصحيح على مجموعة بيانات حيث كان الدواء موجودًا في جزء صغير فقط من الجزيئات، تحولت الخطوط الباهتة والمتقطعة للدواء فجأة إلى شكل مستمر وواضح. كان هذا التحسين فعالاً للغاية لدرجة أنه سمح لهم برؤية بنية الدواء بتفاصيل أعلى مما كان ممكن مع البيانات الأصلية غير المعالجة.

ولإثبات أن هذا التحسين كان حقيقيًا وليس نتاجًا لعمل البرمجيات، أنشأ الفريق مجموعات بيانات اصطناعية عن طريق خلط صور مولدة حاسوبيًا لبروتينات فارغة مع صور لبروتينات مرتبطة بدواء بنسب معروفة. ووجدوا أنه كلما قللوا كمية البروتين المرتبط بالدواء، ضعفت الإشارة، لكن الطريقة استطاعت استعادة شكل الدواء حتى في النقاط التي كان فيها الارتباط يتراوح بين 20% إلى 30% فقط من الجزيئات. وحتى في هذه السيناريوهات الصعبة، استطاع البرنامج التمييز بين الدواء وضجيج الخلفية وشحذ الصورة بما يكفي لرؤية الاتصال بين الدواء والبروتين. وهذا يشير إلى أن الطريقة قوية بما يكفي للتعامل مع الواقع الفوضوي للتجار تجارب الحقيقية، حيث غالبًا ما يكون ارتباط الدواء غير مكتمل وتكون الصور مليئة بالضجيج.

كما قارن الباحثون أداة جديدة بأساليب موجودة تحاول تحسين وضوح الصور. وبينما يمكن للتقنيات الأخرى تنعيم الصور أو توحيد التباين، إلا أنها لا تملك القدرة على تحديد الأجزاء التي تختلف حقًا عن المجموعة المرجعية إحصائيًا. وتتميز الط পদ্ধতি الجديدة لأنها تبحث تحديدًا عن "القيم المتطرفة" (outliers) – أي أجزاء البنية التي لا تتوافق مع نمط البروتين الفارغ. وهذا النهج المستهدف يعني أنها يمكنها العثور على حدث ارتباط الدواء دون أن تتشتت بالباقي من البروتين، مما يجعلها أداة أكثر دقة لاكتشاف الأدوية. وقد أكد الفريق أن نتائجهم كانت متسقة عبر أنواع مختلفة من البروتينات والظروف التجريبية، من العينات البسيطة والمتجانسة إلى بروتينات الغشاء المعقدة ذات الارتباط المنخفض بالدواء.

في الختام، يوفر هذا العمل إطارًا عمليًا لفحص أعداد كبيرة من المرشحين المحتملين للأدوية باستخدام المجهر الإلكتروني بالتبريد. فمن خلال تسهيل رصد أحداث الارتباط الضعيفة والجزئية، تقلل هذه الطة من خطر تفويت مرشح دواء واعد لمجرد أن إشارته كانت باهتة للغاية. إنها تزيد من ثقة العلماء في نتائجهم، مما يضمن أنهم عندما يحددون "ضربة" ناجحة، فإنها تفاعل حقيقي وليست إنذارًا كاذبًا. ومع توجه مجال اكتشاف الأدوية نحو تحليل مئات مجموعات البيانات للعثور على الجيل القادم من الأدوية، ستكون أدوات مثل هذه ضرورية لتحويل كميات هائلة من البيانات الخام إلى رؤى واضحة وقابلة للتطبيق حول كيفية تفاعل الأدوية مع أهدافها.