Facilitating the identification of cryo-EM hit matter in drug discovery with Astex-Faro

In de zoektocht naar het ontwerpen van nieuwe medicijnen beginnen wetenschappers vaak met het vinden van piepkleine chemische fragmenten die aan een specifiek eiwit blijven plakken, vergelijkbaar met een sleutel die het juiste slot vindt. Deze fragmenten zijn meestal erg klein en binden slechts zwak, waardoor ze moeilijk te ontdekken zijn. Om deze interacties te zien, gebruiken onderzoekers een krachtige beeldvormingstechniek genaamd cryo-elektronenmicroscopie, waarbij eiwitten in een dun laagje ijs worden bevroren en duizenden foto's worden genomen om een 3D-model te bouwen. Wanneer een fragment echter slechts aan een klein deel van de eiwitmoleculen in een monster bindt, raakt het signaal verloren in de ruis en verschijnt het als een vage, wazige vlek in plaats van een duidelijke vorm. Dit maakt het moeilijk te bepalen of een kandidaat-medicijn daadwerkelijk heeft gewerkt of dat het beeld het resultaat is van experimentele variatie.

Een team van onderzoekers heeft een nieuwe methode ontwikkeld genaamd Astex-Faro om dit probleem van het opsporen van zwakke signalen in een druk veld op te lossen. In plaats van naar één afbeelding in isolatie te kijken, vergelijkt de methode een nieuwe afbeelding met een grote collectie referentieafbeeldingen die zijn genomen van hetzelfde eiwit wanneer er geen medicijn aan is bevestigd. Door de verschillen tussen de nieuwe afbeelding en de gehele groep referentieafbeeldingen te analyseren, kan het systeem wiskundig identificeren welke delen van de structuur werkelijk anders zijn. Hierdoor kan de software de minuscule, zwakke plekken markeren waar een medicijnfragment mogelijk bindt, zelfs als het slechts in een klein deel van de monsters aanwezig is. De onderzoekers testten deze aanpak op drie verschillende eiwitten, waaronder één die in celmembranen zit, en stelden vast dat het in staat was om deze zwakke interacties betrouwbaar te detecteren en ze duidelijker te maken voor het menselijk oog.

De kern van deze nieuwe aanpak berust op een statistisch kader dat een groep eiwitafbeeldingen behandelt als een enkele, consistente populatie. Voordat er naar een medicijn wordt gezocht, stelt het team eerst vast hoe het lege eiwit eruitziet, oftewel het "apo"-eiwit, door een verzameling van vele verschillende reconstructies van datzelfde lege eiwit te verzamelen. Omdat geen twee microscoopbeelden exact hetzelfde zijn door natuurlijke variaties in het experiment, hadden de onderzoekers een manier nodig om te meten hoe consistent deze beelden met elkaar zijn. Ze introduceerden een nieuwe metriek, die ze Fourier Shell Coherence noemen, om te controleren of de groep afbeeldingen het eens is over de details van de structuur tot aan een specifiek niveau van scherpte. Dit zorgt ervoor dat de verschillen die later worden gevonden ook echte veranderingen in het eiwit zijn en niet slechts willekeurige ruis of inconsistenties in de manier waarop de beelden zijn genomen.

Zodra het team deze betrouwbare basislijn had vastgesteld van hoe het lege eiwit eruitziet, konden ze deze testen tegen een nieuwe afbeelding waar een medicijn aanwezig zou kunnen zijn. De software berekent een score voor elk minuscuul punt in het 3D-model, waarbij wordt gemeten hoeveel dat punt afwijkt van het gemiddelde van de groep lege eiwitten. Als een punt significant anders is, wordt het gemarkeerd als een potentiële bindingsplaats. In tests op een eiwit genaamd bèta-galactosidase, bracht de methode succesvol een medicijnmolecuul in kaart en liet het zelfs zien hoe de eigen onderdelen van het eiwit licht verschuiven om de nieuwe gast te accommoderen. De onderzoekers zagen deze verschuivingen ook in de zijketens van het eiwit, de kleine armpjes die helpen het medicijn op zijn plaats te houden, wat bevestigde dat de veranderingen biologisch betekenisvol waren en niet slechts willekeurige fouten.

De kracht van deze methode wordt nog duidelijker bij het werken met moeilijke doelwitten, zoals eiwitten die ingebed zijn in celmembranen. Deze structuren zijn van nature complexer en variabeler, wat het moeilijker maakt om kleine medicijnmoleculen te zien. Toen het team hun methode toepaste op een membraaneiwit genaamd TRPML1, waren ze in staat om een medicijn te vinden dat diep binnen het membraan bindt, een regio die normaal gesproken erg ruisig en moeilijk te interpreteren is. Hoewel het signaal van het medicijn zwak en gefragmenteerd was, identificeerde de statistische analyse het als een significante verandering ten opzichte van het lege eiwit. De methode onthulde ook hoe de structuur van het eiwit zich rond het medicijn herstructureerde, wat een duidelijk beeld gaf van hoe de interactie werkt, ondanks de uitdagende omgeving.

Misschien wel het meest waardevolle kenmerk van Astex-Faro is het vermogen om signalen te herstellen die zo zwak zijn dat ze normaal gesproken onzichtbaar zouden zijn. Dit gebeurt wanneer een medicijn slechts aan een klein percentage van de eiwitten in een monster bindt, een situatie die bekend staat als partiële bezetting (partial occupancy). In deze gevallen wordt de dichtheid van het medicijn verdund door de vele lege eiwitten, waardoor het verdwijnt in de achtergrond. De onderzoekers toonden aan dat hun methode een specifieke weegfactor kon berekenen om het "lege" signaal wiskundig uit de afbeelding te verwijderen. Toen zij deze correctie toepasten op een dataset waarbij het medicijn slechts in een klein deel van de moleculen aanwezig was, werden de zwakke, onderbroken lijnen van het medicijn plotseling een continue, heldere vorm. Deze verbetering was zo effectief dat het hen in staat stelde de structuur van het medicijn met hogere details te zien dan mogelijk was met de oorspronkelijke, onbewerkte gegevens.

Om te bewijzen dat deze verbetering echt was en geen artefact van de software, creëerden de onderzoekers kunstmatige datasets door computergegenereerde afbeeldingen van lege eiwitten te mengen met afbeeldingen van medicijngebonden eiwitten in bekende verhoudingen. Ze ontdekten dat naarmate ze de hoeveelheid medicijngebonden eiwit verminderden, het signaal zwakker werd, maar de methode kon de vorm van het medicijn nog steeds herstellen tot een punt waarop slechts 20% tot 30% van de moleculen gebonden was. Zelfs in deze moeilijke scenario's kon de software het medicijn onderscheiden van de achtergrondruis en de afbeelding genoeg verscherpen om de verbinding tussen het medicijn en het eiwit te zien. Dit suggereert dat de methode robuust genoeg is om de rommelige realiteit van echte experimenten aan te kunnen, waarbij medicijnbinding vaak incompleet is en de beelden vol ruis zitten.

De onderzoekers vergeleken hun nieuwe instrument ook met bestaande methoden die proberen de helderheid van afbeeldingen te verbeteren. Hoewel andere technieken afbeeldingen kunnen verzachten of het contrast kunnen normaliseren, hebben zij niet het vermogen om statistisch te identificeren welke delen van een afbeelding werkelijk verschillen van een referentiegroep. De nieuwe methode onderscheidt zich omdat deze specifiek zoekt naar uitschieters (outliers): delen van de structuur die niet passen bij het patroon van het lege eiwit. Deze gerichte aanpak betekent dat het een medicijnbindingsgebeurtenis kan vinden zonder afgeleid te worden door de rest van het eiwit, wat het een preciezer instrument maakt voor medicijnontwikkeling. Het team bevestigde dat hun resultaten consistent waren over verschillende soorten eiwitten en experimentele condities, van eenvoudige, uniforme monsters tot complexe membraaneiwitten met een lage medicijnbezetting.

Uiteindelijk biedt dit werk een praktisch kader voor het screenen van grote aantallen potentiële medicijnkandidaten met behulp van cryo-elektronenmicroscopie. Door het gemakkelijker te maken om zwakke en gedeeltelijke bindingsgebeurtenissen op te sporen, vermindert de methode het risico op het missen van een veelbelovende medicijnkandidaat simpelweg omdat het signaal te zwak was om te zien. Het vergroot het vertrouwen van wetenschappers in hun bevindingen, door te garanderen dat wanneer zij een 'hit' identificeren, het een werkelijke interactie is en geen vals alarm. Naarmate het vakgebied van medicijnontwikkeling beweegt naar het analyseren van honderden datasets om de volgende generatie medicijnen te vinden, zullen instrumenten zoals deze essentieel zijn om enorme hoeveelheden ruwe gegevens om te zetten in heldere, bruikbare inzichten over hoe medicijnen met hun doelwitten interageren.