Facilitating the identification of cryo-EM hit matter in drug discovery with Astex-Faro

新薬の設計を追求する中で、科学者たちはしばしば、特定のタンパク質に付着する非常に小さな化学断片を見つけることから始めます。これは、鍵が適切な鍵穴を見つけるようなものです。これらの断片は通常非常に小さく、結合力も非常に弱いため、発見するのが困難です。これらの相互作用を観察するために、研究者はクライオ電子顕微鏡と呼ばれる強力な画像技術を使用します。これは、タンパク質を薄い氷の層の中に凍結させ、数千枚の写真を撮って3Dモデルを構築する手法です。しかし、断片がサンプル中のわずかな数のタンパク質分子にしか結合していない場合、その信号はノイズの中に紛れてしまい、明確な形状ではなく、かすんだぼやけたシミのように見えてしまいます。このことは、薬の候補が実際に機能したのか、それとも画像が実験的な変動によるものなのかを判断することを難しくします。

ある研究チームは、混雑したフィールドの中で弱い信号を見つけ出すというこの問題を解決するために、「Astex-Faro」と呼ばれる新しい手法を開発しました。一つの画像を単独で見るのではなく、この手法は、薬が付着していない状態の同じタンパク質から撮影された大量のリファレンス画像（参照画像）のコレクションと、新しい画像を比較します。新しい画像とリファレンスのグループ全体との違いを分析することで、システムは構造のどの部分が真に異なっているかを数学的に特定できます。これにより、ソフトウェアは、たとえ薬の断片がサンプルのごく一部にしか存在しない場合でも、その薬が結合している可能性のある微細でかすかな地点を強調することができます。研究者たちは、細胞膜の中に位置するタンパク質を含む3つの異なるタンパク質に対してこのアプローチをテストし、これらの弱い相互作用を確実に検出し、それを人間の目により鮮明に見せることができることを発見しました。

この新しいアプローチの中核は、一連のタンパク質画像を、単一の整合した集団として扱う統計的枠組みに基づいています。薬を探す前に、研究者たちはまず、空の状態（apo）のタンパク質がどのような外観であるかを確立します。これは、同じ空のタンパク質の多くの異なる再構成像を集めることによって行われます。実験上の自然な変動により、二つとして同じ顕微鏡画像は存在しないため、チームはこれらの画像が互いにどの程度一致しているかを測定する方法を必要としました。彼らは、「フーリエ・シェル・コヒーレンス（Fourier Shell Coherence）」と呼ぶ新しい指標を導入し、画像のグループが特定の鮮明度レベルまで構造の詳細について合意しているかどうかを確認しました。これにより、後に見つかる差異が、ランダムなノイズや画像の撮影における不一致ではなく、実在するタンパク質の変化であることを保証しています。

チームが空のタンパク質がどのように見えるかという信頼できる基準を確立した後、薬が存在する可能性のある新しい画像に対してテストを行うことができます。ソフトウェアは、3Dモデルのあらゆる微小な点に対してスコアを計算し、その点が空のタンパク質の平均からどれだけ逸脱しているかを測定します。もしある点が有意に異なっている場合、そこは潜在的な結合部位としてフラグが立てられます。ベータガラクトシダーゼと呼ばれるタンパク質を用いたテストでは、この手法は薬の分子を成功裏に強調し、さらにタンパク質自身のパーツが新しいゲストを受け入れるためにどのようにわずかに動いたかさえも示しました。研究者たちは、これらの変化がタンパク質のサイドチェーン（薬を保持するのに役立つ小さな腕の部分）に見られることも確認し、その変化がランダムなエラーではなく、生物学的に意味のあるものであることを裏付けました。

この手法の威力は、細胞膜に埋め込まれたタンパク質のような、扱いにくい標的を扱う際にさらに顕著になります。これらの構造は自然により複雑で変動しやすいため、小さな薬分子を見つけることがより困難になります。チームがTRPML1と呼ばれる膜タンパク質にこの手法を適用した際、彼らは膜の深い部分、すなわち通常はノイズが多く解釈が難しい領域にある薬の結合を見つけることができました。たとえ薬の信号がかすかで断片的であったとしても、統計的分析によって、それが空のタンパク質からの有意な変化であることが特定されました。この手法は、タンパク質の構造が薬の周囲でどのように再編成されたかも明らかにし、困難な環境にもかかわらず、その相互作用がどのように機能するかについての明確な図を提供しました。

Astex-Faroの最も価値のある特徴は、通常であれば目に見えないほど弱い信号を回復できる能力です。これは、薬がサンプルのごくわずかな割合にしか結合していない場合、すなわち「部分的占有（partial occupancy）」と呼ばれる状況で起こります。このようなケースでは、薬の密度は多くの空のタンパク質によって希釈され、背景の中に消えてしまいます。研究者たちは、彼らの手法が「空」の信号を画像から数学的に取り除くための特定の重み付け係数を計算できることを示しました。彼らが、薬が分子のわずかな割合にしか存在しないデータセットにこの補正を適用したところ、かすれた途切れ途切れの線であった薬が、突如として連続した明確な形状となりました。この強化は非常に効果的であり、元の未処理のデータよりも高いレベルの詳細度で薬の構造を見ることができました。

この強化がソフトウェアによるアーティファクト（人工的な偽像）ではなく、現実であることを証明するために、チームは既知の比率で空のタンパク質のコンピュータ生成画像と薬が結合したタンパク質の画像を混合した人工的なデータセットを作成しました。彼らは、薬が結合したタンパク質の量を減らすにつれて信号は弱くなるものの、この手法は、結合している分子が20%から30%しかない段階まで薬の形状を回復できることを見出しました。このような困難なシナリオにおいても、ソフトウェアは背景ノイズから薬を区別し、薬とタンパク質のつながりが見える程度に画像を鮮明にすることができました。これは、薬の結合が不完全であり、画像がノイズに満ちているという現実世界の実験の乱雑な状況に対しても、この手法が堅牢であることを示唆しています。

研究者たちはまた、画像の明瞭さを向上させようとする既存の手法とこの新しいツールを比較しました。他の技術は画像を滑らかにしたりコントラストを正規化したりすることはできますが、画像がリファレンスグループと真に異なっている部分を統計的に特定する能力はありません。この新しい手法が際立っているのは、アウトライヤー（外れ値）、つまり空のタンパク質のパターンに適合しない構造の部分を特異的に探すからです。この標的を絞ったアプローチにより、残りのタンパク質に気を取られることなく、薬の結合イベントを見つけることができます。チームは、単純で均一なサンプルから複雑な膜タンパク質、そして低い薬の占有率に至るまで、結果が異なる種類のタンパク質や実験条件にわたって一貫していることを確認しました。

最終的に、この研究は、クライオ電子顕微鏡を用いた大量の潜在的な薬候補のスクリーニングのための実用的な枠組みを提供します。弱く部分的な結合イベントを検出しやすくすることで、この手法は、信号が微弱すぎて見えないという理由だけで有望な薬の候補を見逃してしまうリスクを軽減します。これは、特定されたヒットが真の相互作用であり、誤報ではないという確信を科学者に与えます。創薬の分野が、次世代の医薬品を見つけ出すために何百ものデータセットの解析へと向かう中で、このようなツールは、膨大な生データを、薬がターゲットとどのように相互作用するかについての明確で実行可能な洞察へと変えるために不可欠となるでしょう。