Facilitating the identification of cryo-EM hit matter in drug discovery with Astex-Faro

새로운 약물을 설계하려는 탐구 과정에서, 과학자들은 종종 특정 단백질에 달라붙는 아주 작은 화학적 파편들을 찾는 것부터 시작하는데, 이는 마치 열쇠가 알맞은 자물쇠를 찾는 것과 같습니다. 이러한 파편들은 대개 매우 작고 결합력이 약하기 때문에 찾아내기가 매우 어렵습니다. 이러한 상호작용을 관찰하기 위해 연구자들은 저온 전자 현미경(cryo-electron microscopy)이라는 강력한 이미징 기술을 사용하는데, 이 기술은 단백질을 얇은 얼음 층 속에 얼린 후 수천 장의 사진을 찍어 3D 모델을 구축합니다. 그러나 파편이 샘플 내의 단백질 분자 중 극히 일부에만 결합할 경우, 그 신호는 노이즈 속에 묻혀 명확한 형태가 아닌 희미하고 흐릿한 얼룩처럼 보이게 됩니다. 이는 약물 후보 물질이 실제로 작동했는지, 아니면 실험적 변이에 의한 결과인지를 구별하기 어렵게 만듭니다.

연구팀은 이처럼 혼잡한 환경에서 약한 신호를 포착하는 문제를 해결하기 위해 'Astex-Faro'라고 불리는 새로운 방법을 개발했습니다. 이 방법은 하나의 이미지를 고립된 상태로 보는 대신, 약물이 부착되지 않은 상태의 동일한 단백질로부터 얻은 방대한 참조 이미지 모음과 새로운 이미지를 비교합니다. 새 이미지를 참조 이미지 전체와 비교 분석함으로써, 시스템은 구조의 어느 부분이 진정으로 다른지를 수학적으로 식별할 수 있습니다. 이를 통해 소프트웨어는 약물 파편이 결합할 수 있는 아주 작고 희미한 지점들을 강조할 수 있으며, 이는 파편이 샘플의 아주 적은 비율에만 존재하더라도 가능합니다. 연구진은 이 접근 방식을 세포막 안에 위치한 단백질을 포함한 세 가지 서로 다른 단백질에 테스트하였으며, 이를 통해 이러한 약한 상호작용을 안정적으로 감지하고 인간의 눈에 더 명확하게 보이도록 할 수 있음을 확인했습니다.

이 새로운 접근 방식의 핵심은 단백질 이미지 그룹을 하나의 일관된 집단으로 취급하는 통계적 프레임워크에 기반합니다. 약물을 찾기 전, 연구진은 먼저 비어 있는 상태, 즉 "아포(apo)" 상태의 단백질이 어떻게 생겼는지를 확립하기 위해 동일한 빈 단백질의 다양한 재구성 모델들을 모읍니다. 실험의 자연적인 변동성 때문에 두 개의 현미경 이미지는 정확히 일치할 수 없으므로, 연구팀은 이 이미지들이 서로 얼마나 일치하는지를 측정할 방법이 필요했습니다. 그들은 '푸리에 쉘 코히어런스(Fourier Shell Coherence)'라고 부르는 새로운 지표를 도입하여, 이미지 그룹이 특정 수준의 선명도까지 구조의 세부 사항에 대해 얼마나 일치하는지 확인했습니다. 이는 나중에 발견될 차이점이 단순한 무작위 노이즈나 이미지 촬영 방식의 불일치가 아니라 실제 단백체의 변화임을 보장하기 위함입니다.

연구팀이 빈 단백질의 모습에 대한 신뢰할 수 있는 기준점을 확립한 후, 약물이 존재할 수 있는 새로운 이미지를 테스트할 수 있었습니다. 소프트웨어는 3D 모델의 모든 미세한 지점에 대해 점수를 계산하며, 해당 지점이 빈 단백질 그룹의 평균에서 얼마나 벗어나는지를 측정합니다. 만약 특정 지점이 유의미하게 다르다면, 그곳은 잠재적인 결합 부위로 표시됩니다. 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase)라는 단백질을 대상으로 한 테스트에서, 이 방법은 약물 분자를 성공적으로 강조했을 뿐만 아니라, 단백질의 자체 부분이 새로운 손님을 수용하기 위해 어떻게 미세하게 움직이는지도 보여주었습니다. 연구진은 또한 약물을 붙잡아두는 데 도움을 주는 작은 팔인 단백질의 측쇄(side chains)에서도 이러한 변화를 관찰하였으며, 이를 통해 변화가 단순한 무작위 오류가 아닌 생물학적으로 의미 있는 변화임을 확인했습니다.

이 방법의 위력은 세포막에 박혀 있는 단백질과 같이 다루기 어려운 표적을 다룰 때 더욱 분명해집니다. 이러한 구조들은 본질적으로 더 복합적이고 가변적이어서 작은 약물 분자를 찾아내기가 더 어렵습니다. 연구팀이 TRPML1이라는 막 단백질에 이 방법을 적용했을 때, 그들은 보통 노이즈가 심하고 해석하기 어려운 영역인 막 깊숙한 곳에서 약물이 결합하는 것을 찾아낼 수 있었습니다. 비록 약물의 신호가 희미하고 끊어져 있었지만, 통계적 분석은 이를 빈 단백질과의 유의미한 차이로 식별해 냈습니다. 또한 이 방법은 단백질이 약물 주변으로 구조를 재배열하는 모습을 드러내어, 까다로운 환경 속에서도 상호작용이 어떻게 일어나는지에 대한 명확한 그림을 제공했습니다.

Astex-Faro의 가장 가치 있는 특징은 아마도 정상적인 상태에서는 보이지 않을 정도로 약한 신호를 복구하는 능력입니다. 이는 약물이 샘플 내 단백질의 아주 적은 비율에만 결합할 때 발생하며, 이를 '부분 점유(partial occupancy)'라고 합니다. 이러한 경우, 약물의 밀도는 많은 수의 빈 단백질에 의해 희석되어 배경 속으로 사라져 버립니다. 연구진은 이 방법이 이미지에서 "빈" 신호를 수학적으로 제거할 수 있는 특정 가중치 요인을 계산할 수 있음을 보여주었습니다. 약물이 분자의 아주 적은 부분에만 존재하는 데이터셋에 이 보정을 적용했을 때, 끊어진 듯 희미했던 약물의 선들이 갑자기 연속적이고 명확한 형태로 나타났습니다. 이러한 향상은 매우 효과적이어서, 가공되지 않은 원래의 데이터보다 더 높은 수준의 세부 정보로 약물의 구조를 볼 수 있게 해주었습니다.

이러한 향상이 소프트웨어의 인위적인 결과(artifact)가 아니라 실제임을 증명하기 위해, 연구팀은 컴퓨터로 생성된 빈 단백질 이미지와 알려진 비율로 혼합된 약물 결합 단백질 이미지를 사용하여 인공 데이터셋을 만들었습니다. 그들은 약물이 결합된 단백질의 양을 줄임에 따라 신호가 약해지지만, 결합된 분자가 20%에서 30% 정도만 남은 상황에서도 이 방법이 약물의 형태를 복구할 수 있다는 것을 발견했습니다. 이러한 어려운 시나리오에서도 소프트웨어는 배경 노이즈로부터 약물을 구별해 낼 수 있었으며, 약물과 단백질 사이의 연결을 볼 수 있을 만큼 이미지를 선명하게 만들 수 있었습니다. 이는 이 방법이 약물 결합이 불완전하고 이미지가 노이즈로 가득 찬 실제 실험의 무질서한 현실을 다룰 수 있을 만큼 견고하다는 것을 시사합니다.

연구진은 또한 이미지의 선명도를 개선하려는 기존의 방법들과 이 새로운 도구를 비교했습니다. 다른 기술들은 이미지를 매끄럽게 하거나 대비를 정규화할 수는 있지만, 참조 그룹과 다른 부분이 무엇인지 통계적으로 식별하는 능력은 없습니다. 이 새로운 방법은 '이상치(outlier)'—즉, 빈 단백질의 패턴과 맞지 않는 부분—를 구체적으로 찾는다는 점에서 차별화됩니다. 이러한 타겟팅된 접근 방식 덕분에, 이 방법은 나머지 단백질 부분에 의해 방해받지 않고 약물 결야 사건을 찾아낼 수 있어 더욱 정밀한 약물 발견 도구가 됩니다. 연구팀은 단순하고 균일한 샘플부터 복잡한 막 단백질 및 낮은 약물 점유율에 이르기까지, 자신들의 결과가 다양한 유형의 단백질과 실험 조건에서 일관되게 나타남을 확인했습니다.

궁극적으로, 이 연구는 저온 전자 현미경을 사용하여 방대한 수의 잠재적 약물 후보 물질을 스크리닝할 수 있는 실용적인 프레임워크를 제공합니다. 약한 결합 및 부분 점유 이벤트를 포착하기 쉽게 만듦으로써, 이 방법은 신호가 너무 희미해서 유망한 약물 후보를 놓칠 위험을 줄여줍니다. 이는 과학자들이 자신의 발견에 대한 확신을 높여주며, 식별된 '히트(hit)'가 단순한 가짜 신호가 아니라 실제적인 상호작용임을 보장합니다. 약물 발견 분야가 차세대 의약품을 찾기 위해 수백 개의 데이터셋을 분석하는 방향으로 나아가고 있는 가운데, 이러한 도구는 방대한 양의 원시 데이터를 약물과 표적 간의 상호작용에 대한 명확하고 실행 가능한 통찰력으로 바꾸는 데 필수적일 것입니다.