Facilitating the identification of cryo-EM hit matter in drug discovery with Astex-Faro

नई दवाओं के डिजाइन की खोज में, वैज्ञानिक अक्सर उन विशिष्ट प्रोटीनों से चिपकने वाले छोटे रासायनिक टुकड़ों को खोजने से शुरुआत करते हैं, जो बिल्कुल वैसा ही है जैसे एक चाबी का सही ताले को ढूंढना। ये टुकड़े आमतौर पर बहुत छोटे होते हैं और बहुत ही कमजोर रूप से बंधते हैं, जिससे उन्हें पहचानना कठिन हो जाता है। इन अंतःक्रियाओं (interactions) को देखने के लिए, शोधकर्ता क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी नामक एक शक्तिशाली इमेजिंग तकनीक का उपयोग करते हैं, जो प्रोटीन को बर्फ की एक पतली परत में जमा देती है और 3D मॉडल बनाने के लिए हजारों तस्वीरें लेती है। हालांकि, जब एक टुकड़ा नमूने के केवल कुछ प्रोटीन अणुओं से बंधता है, तो उसका संकेत शोर (noise) में खो जाता है, जिससे वह एक स्पष्ट आकार के बजाय एक धुंधले धब्बे के रूप में दिखाई देता है। यह समझना कठिन बना देता है कि क्या किसी दवा के उम्मीदवार ने वास्तव में काम किया है या वह छवि प्रयोगात्मक भिन्नता का परिणाम है।

शोधकर्ताओं की एक टीम ने भीड़ भरे क्षेत्र में कमजोर संकेतों को पहचानने की इस समस्या को हल करने के लिए 'एस्टेक्स-फारो' (Astex-Faro) नामक एक नई विधि विकसित की है। एक अकेले चित्र को अलग से देखने के बजाय, यह विधि एक नए चित्र की तुलना संदर्भ चित्रों के एक बड़े संग्रह से करती है, जो उसी प्रोटीन के उन चित्रों से लिए गए हैं जब उसमें कोई दवा जुड़ी नहीं होती है। नए चित्र और संदर्भ चित्रों के पूरे समूह के बीच के अंतर का विश्लेषण करके, सिस्टम गणितीय रूप से यह पहचान सकता है कि संरचना के कौन से हिस्से वास्तव में भिन्न हैं। यह सॉफ्टवेयर को उन सूक्ष्म, धुंधले स्थानों को उजागर करने की अनुमति देता है जहाँ एक दवा का टुकड़ा बंध सकता है, भले ही वह नमूनों के एक छोटे से अंश में ही मौजूद हो। शोधकर्ताओं ने इस दृष्टिकोण का परीक्षण तीन अलग-अलग प्रोटीनों पर किया, जिसमें एक भी शामिल था जो कोशिका झिल्ली (cell membranes) के भीतर स्थित होता है, और पाया कि यह इन कमजोर अंतःक्रियाओं को विश्वसनीय रूप से पहचान सकता है और उन्हें मानवीय आंखों के लिए अधिक स्पष्ट बना सकता है।

इस नए दृष्टिकोण का मूल आधार एक सांख्यिकीय ढांचा है जो प्रोटीन चित्रों के एक समूह को एक एकल, सुसंगत जनसंख्या के रूप में मानता है। दवा खोजने से पहले, शोधकर्ता पहले यह स्थापित करते हैं कि खाली प्रोटीन कैसा दिखता है, या "अपो" (apo), इसके लिए उसी खाली प्रोटीन के कई अलग-अलग पुनर्निर्माणों (reconstructions) का एक पूल एकत्र करते हैं। चूंकि प्रयोगाችን की प्राकृतिक विविधताओं के कारण कोई भी दो माइक्रोस्कोप चित्र बिल्कुल एक जैसे नहीं होते हैं, इसलिए टीम को यह मापने के लिए एक तरीके की आवश्यकता थी कि वे चित्र एक-दूसरे के साथ कितने सुसंगत हैं। उन्होंने एक नया मीट्रिक पेश किया, जिसे वे 'फूरियर शेल कोहेरेंस' (Fourier Shell Coherence) कहते हैं, जो यह जांचने के लिए है कि चित्रों का समूह एक विशिष्ट स्तर की स्पष्टता तक संरचना के विवरणों पर कितना सहमत है। यह सुनिश्चित करता है कि बाद में पाए गए कोई भी अंतर वास्तविक परिवर्तन हैं, न कि केवल यादृच्छिक शोर या छवियों को लेने के तरीकों में विसंगतियां।

एक बार जब टीम ने यह स्थापित कर लिया कि खाली प्रोटीन वास्तव में कैसा दिखता है, तो वे एक नए चित्र का परीक्षण कर सके जहाँ एक दवा मौजूद हो सकती है। सॉफ्टवेयर खाली प्रोटीन के औसत से प्रत्येक सूक्ष्म बिंदु की गणना करता है, यह मापते हुए कि वह बिंदु कितना विचलित होता है। यदि कोई बिंदु महत्वपूर्ण रूप से भिन्न है, तो उसे एक संभावित बाइंडिंग साइट के रूप में चिह्नित किया जाता है। बीटा-गैलेक्टोसिडेज़ (beta-galactosidase) नामक प्रोटीन पर परीक्षणों में, पद्धति ने सफलतापूर्वक एक दवा के अणु को उजागर किया और यहाँ तक कि यह भी दिखाया कि प्रोटीन के अपने हिस्से नए अतिथि को जगह देने के लिए कैसे थोड़े से खिसकते हैं। शोधकर्ताओं ने प्रोटीन के साइड चेन (side chains) में भी ये बदलाव देखे, जो वे छोटे हाथ हैं जो दवा को थामे रखने में मदद करते हैं, जिससे पुष्टि हुई कि परिवर्तन जैविक रूप से सार्थक थे और केवल यादृच्छिक त्रुटियां नहीं थे।

इस पद्धति की शक्ति उन कठिन लक्ष्यों के साथ निपटने में और भी स्पष्ट हो जाती है, जैसे कि कोशिका झिल्ली में धंसी हुई प्रोटीन। ये संरचनाएं स्वाभाविक रूप से अधिक जटिल और परिवर्तनशील होती हैं, जिससे छोटी दवा अणुओं को देखना कठिन हो जाता है। जब टीम ने TRPML1 नामक एक झिल्ली प्रोटीन पर अपनी विधि लागू की, तो वे झिल्ली के भीतर गहराई में बंधी एक दवा को खोजने में सक्षम रहे, जो एक ऐसा क्षेत्र है जो आमतौर पर बहुत शोर वाला और व्याख्या करने में कठिन होता है। भले ही दवा का संकेत धुंधला और टूटा हुआ था, सांख्यिकीय विश्लेषण ने इसे खाली प्रोटीन से एक महत्वपूर्ण परिवर्तन के रूप में पहचाना। पद्धति ने यह भी प्रकट किया कि प्रोटीन की संरचना ने दवा के चारों ओर खुद को पुनर्गठित किया, जिससे एक स्पष्ट तस्वीर मिली कि यह अंतःक्रिया कैसे काम करती है, बावजूद इसके कि वातावरण चुनौतीपूर्ण था।

शायद एस्टेक्स-फारो की सबसे मूल्यवान विशेषता उन संकेतों को पुनः प्राप्त करने की क्षमता है जो इतने कमजोर हैं कि वे सामान्य रूप से अदृश्य हो जाते हैं। यह तब होता है जब एक दवा केवल नमूनों के एक छोटे प्रतिशत में बंधती है, जिसे 'पार्शियल ऑक्यूपेंसी' (partial occupancy) कहा जाता है। इन मामलों में, दवा का घनत्व कई खाली प्रोटीनों द्वारा पतला कर दिया जाता है, जिससे वह बैकग्राउंड में गायब हो जाता है। शोधकर्ताओं ने दिखाया कि उनकी विधि एक विशिष्ट वेटिंग फैक्टर (weighting factor) की गणना कर सकती है जो गणितीय रूप से छवि से "खाली" सिग्नल को हटा देता है। जब उन्होंने इस सुधार को एक ऐसे डेटासेट पर लागू किया जहाँ दवा केवल अणुओं के एक छोटे से अंश में मौजूद थी, तो दवा की धुंधली, टूटी हुई रेखाएं अचानक एक निरंतर, स्पष्ट आकार बन गईं। यह संवर्धन इतना प्रभावी था कि इसने उन्हें मूल, अनप्रोसेस्ड डेटा की तुलना में उच्च स्तर के विवरण के साथ दवा की संरचना देखने की अनुमति दी।

यह सिद्ध करने के लिए कि यह संवर्धन वास्तविक था और सॉफ्टवेयर का कोई आर्टिफैक्ट (artifact) नहीं था, टीम ने कंप्यूटर-जनरेटेड खाली प्रोटीनों के चित्रों को ज्ञात अनुपातों में दवा-बद्ध प्रोटीनों के चित्रों के साथ मिलाकर कृत्रिम डेटासेट बनाए। उन्होंने पाया कि जैसे-जैसे उन्होंने दवा-बद्ध प्रोटीन की मात्रा कम की, सिग्नल कमजोर होता गया, लेकिन पद्धति अभी भी दवा के आकार को तब तक पुनः प्राप्त कर सकती थी जब तक कि केवल 20% से 30% अणु ही बंधे थे। इन कठिन परिदृश्यों में भी, सॉफ्टवेयर पृष्ठभूमि के शोर से दवा को अलग कर सकता था और छवि को इतना स्पष्ट कर सकता था कि दवा और प्रोटीन के बीच के संबंध को देखा जा सके। यह सुझाव देता है कि पद्धति वास्तविक दुनिया के प्रयोगों की अव्यवस्थित वास्तविकता को संभालने के लिए पर्याप्त मजबूत है, जहाँ दवा का बंधन अक्सर अधूरा होता है और चित्र शोर से भरे होते हैं।

शोधकर्ताओं ने अपने नए उपकरण की तुलना मौजूदा विधियों से भी की जो छवि की स्पष्टता में सुधार करने का प्रयास करती हैं। जबकि अन्य तकनीकें छवियों को स्मूथ कर सकती हैं या कंट्रास्ट को सामान्य कर सकती हैं, उनमें सांख्यिकीय रूप से यह पहचानने की क्षमता नहीं है कि चित्र का कौन सा हिस्सा संदर्भ समूह से वास्तव में भिन्न है। नया तरीका इसलिए अलग है क्योंकि यह विशेष रूप से आउटलेर्स (outliers) की तलाश करता है—संरचना के वे हिस्से जो खाली प्रोटीन के पैटर्न में फिट नहीं होते हैं। यह लक्षित दृष्टिकोण सुनिश्चित करता है कि यह खाली प्रोटीन के बाकी हिस्सों से विचलित हुए बिना एक दवा बाइंडिंग घटना को खोज सके, जिससे यह दवा की खोज के लिए एक अधिक सटीक उपकरण बन जाता है। टीम ने पुष्टि की कि उनके परिणाम विभिन्न प्रकार के प्रोटीनों और प्रयोगात्मक स्थितियों में सुसंगत थे, सरल, समान नमूनों से लेकर जटिल झिल्ली प्रोटीन और कम दवा ऑक्यूपेंसी तक।

अंततः, यह कार्य क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके संभावित दवा उम्मीदवारों की बड़ी संख्या में स्क्रीनिंग करने के लिए एक व्यावहारिक ढांचा प्रदान करता है। कमजोर और आंशिक बाइंडिंग घटनाओं को पहचानना आसान बनाकर, यह विधि एक आशाजनक दवा उम्मीदवार को केवल इसलिए खो देने के जोखिम को कम करती है क्योंकि उसका संकेत बहुत धुंधला था। यह वैज्ञानिकों के अपने निष्कर्षों में विश्वास को बढ़ाता है, यह सुनिश्चित करता है कि जब वे किसी 'हिट' की पहचान करते हैं, तो वह एक वास्तविक अंतःक्रिया है और कोई गलत सूचना नहीं। जैसे-जैसे दवा की खोज का क्षेत्र अगली पीढ़ी की दवाओं को खोजने के लिए सैकड़ों डेटासेट के विश्लेषण की ओर बढ़ रहा है, इस तरह के उपकरण विशाल मात्रा में कच्चे डेटा को स्पष्ट, कार्रवाई योग्य अंतर्दृष्टि में बदलने के लिए आवश्यक होंगे कि दवाएं अपने लक्ष्यों के साथ कैसे अंतःक्रिया करती हैं।