Facilitating the identification of cryo-EM hit matter in drug discovery with Astex-Faro

Nella ricerca di nuovi farmaci, gli scienziati spesso iniziano cercando minuscoli frammenti chimici che si legano a una specifica proteina, proprio come una chiave che trova la serratura giusta. Questi frammenti sono solitamente molto piccoli e si legano solo debolmente, il che li rende difficili da individuare. Per osservare queste interazioni, i ricercatori utilizzano una potente tecnica di imaging chiamata criomicroscopia elettronica, che congela le proteine in un sottile strato di ghiaccio e scatta migliaia di foto per costruire un modello 3D. Tuttavia, quando un frammento si lega solo a poche delle molecole proteiche in un campione, il suo segnale si perde nel rumore, apparendo come una macchia debole e sfocata invece di una forma nitida. Ciò rende difficile capire se un candidato farmaco abbia effettivamente funzionato o se l'immagine sia il risultato di una variazione sperimentale.

Un team di ricercatori ha sviluppato un nuovo metodo chiamato Astex-Faro per risolvere questo problema del rilevamento di segnali deboli in un campo affollato. Invece di guardare un'immagine isolata, il metodo confronta una nuova immagine con una vasta collezione di immagini di riferimento scattate sulla stessa proteina quando non ha alcun farmaco attaccato. Analizzando le differuzioni tra la nuova immagine e l'intero gruppo di immagini di riferimento, il sistema può identificare matematicamente quali parti della struttura sono realmente diverse. Ciò consente al software di evidenziare i punti minuscoli e deboli dove un frammento di farmaco potrebbe legarsi, anche se è presente solo in una piccola frazione dei campioni. I ricercatori hanno testato questo approccio su tre diverse proteine, inclusa una che si trova all'interno delle membrane cellulari, e hanno scoperto che poteva rilevare in modo affidabile queste deboli interazioni e renderle più chiare all'occhio umano.

Il nucleo di questo nuovo approccio si basa su un quadro statistico che tratta un gruppo di immagini proteiche come una singola popolazione coerente. Prima di cercare un farmaco, i ricercatori stabiliscono prima come appare la proteina quando è vuota, o "apo", raccogliendo un insieme di molte diverse ricostruzioni di quella stessa proteina vuota. Poiché non due immagini al microscopio sono esattamente uguali a causa delle variazioni naturali nell'esperimento, il team aveva bisogno di un modo per misurare quanto queste immagini siano coerenti tra loro. Hanno introdotto una nuova metrica, che chiamano Coerenza della Shell di Fourier, per verificare se il gruppo di immagini concordi sui dettagli della struttura fino a un certo livello di nitidezza. Ciò assicura che qualsiasi differenza trovata in seguito sia un cambiamento reale nella proteina e non solo rumore casuale o incongruenze nel modo in cui le immagini sono state acquisite.

Una volta che il team ha stabilito questa base affidabile di come appare la proteina vuota, poteva testarla contro una nuova immagine dove potrebbe essere presente un farmaco. Il software calcola un punteggio per ogni minuscolo punto nel modello 3D, misurando quanto quel punto devii dalla media del gruppo della proteina vuota. Se un punto è significativamente diverso, viene segnalato come un potenziale sito di legame. Nei test su una proteina chiamata beta-galattosidasi, il metodo ha evidenziato con successo una molecola di farmaco e ha persino mostrato come le parti della proteina stessa si spostino leggermente per accogliere il nuovo ospite. I ricercatori hanno osservato questi spostamenti anche nelle catene laterali della proteina, ovvero le piccole braccia che aiutano a trattenere il farmaco, confermando che i cambiamenti erano biologicamente significativi e non semplici errori casuali.

La potenza di questo metodo diventa ancora più evidente quando si tratta di bersagli difficili, come le proteine immerse nelle membrane cellulari. Queste strutture sono naturalmente più complesse e variabili, rendendo più difficile vedere piccole molecole di farmaci. Quando il team ha applicato il proprio metodo a una proteina di membrana chiamata TRPML1, è stato in grado di trovare un farmaco che si lega in profondità nella membrana, una regione che è solitamente molto rumorosa e difficile da interpretare. Anche se il segnale del farmaco era debole e frammentato, l'analisi statistica lo ha identificato come un cambiamento significativo rispetto alla proteina vuota. Il metodo ha anche rivelato che la struttura della proteina si è riorganizzata attorno al farmaco, fornendo un'immagine chiara di come avvenga l'interazione nonostante l'ambiente impegnativo.

Forse la caratteristica più preziosa di Astex-Faro è la sua capacità di recuperare segnali che sarebbero normalmente invisibili. Ciò accade quando un farmaco si lega solo a una piccola percentuale delle proteine in un campione, una situazione nota come occupanza parziale. In questi casi, la densità del farmaco è diluita dalle molte proteine vuote, rendendolo invisibile nello sfondo. I ricercatori hanno dimostrato che il loro metodo può calcolare un fattore di ponderazione specifico per rimuovere matematicamente il segnale "vuoto" dall'immagine. Quando hanno applicato questa correzione a un set di dati in cui il farmaco era presente solo in una piccola frazione delle molecole, le linee deboli e frammentate del farmaco sono diventate improvvisamente una forma continua e chiara. Questo potenziamento è stato così efficace da consentire di vedere la struttura del farmaco con livelli di dettaglio superiori rispetto a quelli possibili con i dati originali non elaborati.

Per dimostrare che questo potenziamento fosse reale e non un artefatto del software, il team ha creato dataset artificiali mescolando immagini di proteine vuote generate al computer con immagini di proteine legate al farmaco in rapporti noti. Hanno scoperto che, riducendo la quantità di proteina legata al farmaco, il segnale si indeboliva, ma il metodo era comunque in grado di recuperare la forma del farmaco fino a un punto in cui solo il 20% o il 30% delle molecole era legato. Anche in questi scenari difficili, il software riusciva a distinguere il farmaco dal rumore di fondo e ad affinare l'immagine abbastanza da vedere la connessione tra il farmaco e la proteina. Ciò suggerisce che il metodo sia robusto abbastanza da gestire la realtà disordinata degli esperimenti reali, dove il legame del farmaco è spesso incompleto e le immagini sono piene di rumore.

I ricercatori hanno anche confrontato il loro nuovo strumento con i metodi esistenti che cercano di migliorare la chiarezza dell'immagine. Mentre altre tecniche possono levigare le immagini o normalizzare il contrasto, non hanno la capacità di identificare statisticamente quali parti di un'immagine siano realmente diverse da un gruppo di riferimento. Il nuovo metodo si distingue perché cerca specificamente gli outlier — parti della struttura che non si adattano al modello della proteina vuota. Questo approccio mirato significa che può trovare un evento di legame del farmaco senza lasciarsi distrarre dal resto della proteina, rendendolo uno strumento più preciso per la scoperta di farmaci. Il team ha confermato che i loro risultati erano coerenti attraverso diversi tipi di proteine e condizioni sperimentali, dai campioni semplici e uniformi alle complesse proteine di membrana con bassa occupanza di farmaco.

In definitiva, questo lavoro fornisce un quadro pratico per lo screening di un gran numero di potenziali candidati farmaci utilizzando la criomicroscopia elettronica. Rendendo più facile individuare eventi di legame deboli e parziali, il metodo riduce il rischio di perdere un promettente candidato farmaco semplicemente perché il segnale era troppo debole per essere visto. Aumenta la fiducia degli scienziati nei propri risultati, assicurando che quando identificano un "hit", si tratti di un'interazione genuina e non di un falso allarme. Mentre il campo della scoperta di farmaci si muove verso l'analisi di centinaia di dataset per trovare la prossima generazione di medicinali, strumenti come questo saranno essenziali per trasformare enormi quantità di dati grezzi in intuizioni chiare e azionabili su come i farmaci interagiscono con i loro bersagli.