MOET-assisted CRISPR/Cas9-mediated MSTN genome editing in caprine embryos by electroporation and embryo transfer

في عالم تربية الماشية، كان الهدف منذ أمد بعيد هو تحسين الحيوانات التي توفر الغذاء وسبل العيش للملايين. وعلى مدى عقود، اعتمد المزارعون والعلماء على التربية الانتقائية، منتظرين الطبيعة لتنتج حيوانات ذات سمات أفضل، أو استخدام التقنيات التناسلية لمضاعفة نسل أفضل الأداء. ومع ذلك، فإن هذه العملية بطيئة ومحدودة بالتنوع الجيني الموجود بالفعل في القطيع. وتوفر أداة أحدث، تُعرف باسم تحرير الجينوم، طريقة لإجراء تغييرات دقيقة على الشفرة الوراثية للحيوان، مما قد يؤدي إلى إدخال سمات مرغوبة بشكل أسرع بكثير من الطرق التقليدية. وقد أصبح جين محدد، يعمل بمثابة مكبح طبيعي لنمو العضلات، هدفاً رئيسياً لهذه التقنية. فعندما يتم إرخاء هذا المكبح أو إزالته، تطور الحيوانات عضلات أكثر، وهي سمة ذات قيمة عالية لإنتاج اللحوم. ويكمن التحدي في إيصال أدوات التحرير إلى المراحل الأولى من الحياة دون الإضرار بالجنين الحساس، وهي مهمة تتطلب توازناً بين الدقة والرفق.

لقد اتخذ فريق من الباحثين في المعهد المركزي لأبحاث الماعز في الهند خطوة كبيرة نحو حل هذا التحدي من خلال الجمع بين تقنيتين راسختين: طريقة لجمع العديد من الأجنة في وقت واحد، وطريقة لإيصال الأدوات الجينية إليها دون جراحة غازية. ركز الباحثون على جين الميوستاتين، وهو المنظم الطبيعي الذي يحد من حجم العضلات في الماعز. وكان هدفهم هو معرفة ما إذا كان بإمكانهم تعطيل هذا الجين مؤقتاً في أجنة الماعز مباشرة بعد الإخصاب، باستخدام أداة جزيئية تعمل مثل مقص لقطع الحمض النووي في نقطة محددة. وللقيام بذلك، استخدموا تقنية تسمى "التثقيب الكهربائي" (electroporation)، والتي تستخدم نبضات كهربائية قصيرة ومتحكم بها لفتح ثقوب صغيرة ومؤقتة في غشاء الخلية، مما يسمح لأدوات التحرير بالانزلاق إلى الداخل. ويتجنب هذا النهج الحاجة إلى حقن كل جنين على حدء بإبرة، وهي عملية صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً عند التعامل مع العديد من الأجنة في آن واحد.

بدأت الدراسة بثماني معزات تم علاجهن بالهرمونات لإنتاج عدة بويضات في وقت واحد، وهي عملية تُعرف باسم "فرط التبويض". وجمع الباحثون ثمانية وسبعين بيضة مخصبة، أو زيجوتات مفترضة، من هذه الحيوانات باستخدام إجراء جراحي طفيف التوغل. ثم وُضعت هذه الأجنة الصغيرة في محلول يحتوي على أدوات التحرير الجيني، والتي كانت تتكون من بروتين وجزيء دليل مصمم للعثور على جين الميوستاتين. تعرضت المجموعة لثلاث نبضات كهربائية قصيرة، مدة كل منها ثلاثة مللي ثانية، للمساعدة في دخول الأدوات إلى الخلايا. وبعد المعالجة الكهربائية، أعيدت الأجنة إلى بيئة دافئة ومتحكم بها لتنمو. ومن المثير للإعجاب أن جميع الأجنة الثمانية والسبعين تطورت إلى مرحلة "المورولا" (البرعم) في المختبر، مع تقدم اثنتين منها إلى مرحلة "البلاستوسيست" (الكيسة الأريمية)، وهي مرحلة أكثر تقدماً في النمو.

وللتحقق من أن عملية التحرير قد نجحت بالفعل، فحص العلماء أربعة من أجنة مرحلة المورولا. واستخلصوا المادة الوراثية من هذه الخلايا وبحثوا عن علامات تشير إلى أن جين الميوستاتين قد تم قطعه وإصلاحه بأخطاء، وهي الطريقة التي يتم بها تعطيل الجين. وأظهر التحليل أن ثلاثة من أصل أربعة أجنة، أو 75 بالمائة، تحمل التغيير الجيني المنشود. وهذا أكد أن الطريقة الكهربائية نجحت في إيصال أدوات التحرير وأن الأدوات عملت بشكل صحيح داخل الخلايا النامية. ثم انتقل الباحثون إلى المرحلة الحرجة التالية: معرفة ما إذا كان بإمكان هذه الأجنة أن تنمو لتصبح جنيناً داخل أنثى الماعز. واختاروا أربعة أجنة وصلت إلى مرحلة الخلايا الأربع ونقلوها إلى أنثى واحدة تم ضبط دورتها لتكون جاهزة للحمل.

كانت عملية النقل ناجحة. فأصبحت الماعز المستقبِلة حاملاً، وأكدت فحوصات الموجات فوق الصوتية وجود أجنة سليمة بقلوب نابضة. ولسوء الحظ، ماتت الأم بسبب الالتهاب الرئوي في اليوم السابع والخمسين من فترة الحمل، قبل وقت طويل من وصول الحمل إلى مدته الكاملة. ومع ذلك، تمكن الباحثون من استعادة جنينين سليمين من الرحم. وبدا كلا الجنينين طبيعيين في الشكل والحجم، مع عدم وجود علامات مرئية لمشاكل نمو، مما يشير إلى أن عملية التحرير لم تضر نموهما. ثم فحص الفريق المادة الوراثية من آذان هذين الجنينين لمعرفة ما إذا كان جين الميوستاتين قد تم تحريره. وأظهرت النتائج أن أحد الجنينين، وهو ذكر، يحمل التعديل الجيني، بينما لم يحمله الآخر. وتبرز هذه النتيجة أنه حتى عندما تتلقى الأجنة نفس المعاملة، يمكن أن يحدث التحرير في بعضها دون غيرها، وهو تباين معروف في هذا النوع من العلوم.

يُظهر هذا العمل أنه من الممكن الجمع بين جمع أجنة متعددة من مانح واحد وبين طريقة توصيل كهربائية غير غازية لتحرير جينوم الماعز. وتثبت الدراسة أن الأجنة يمكنها البقاء على قيد الحياة بعد النبضات الكهربائية، والاستمرار في النمو في المختبر، والزرع بنجاح في مستقبِلة لتنمو إلى أجنة. ورغم أن التحرير لم يكن ناجحاً في كل حالة على حدة، إلا أن حقيقة اكتشاف التعديل في كل من الأجنة المبكرة التي نُميت في المختبر وفي جنين نما داخل أم، تُظهر أن النهج قابل للتطبيق. لقد وضع الباحثون سير عمل يربط بين استعادة الأجنة من مانح قيم، وتطبيق تحرير الجينوم، ونقل تلك الأجنة إلى أم بديلة. وتوفر هذه المنصة المتكاملة أساساً للجهود المستقبلية لإنتاج ماعز بزيادة في نمو العضلات، مما يوفر مساراً أكثر كفاءة لتحسين سمات الماشية مقارنة بالتربية التقليدية وحدها.