MOET-assisted CRISPR/Cas9-mediated MSTN genome editing in caprine embryos by electroporation and embryo transfer

No mundo da pecuária, o objetivo tem sido, há muito tempo, melhorar os animais que fornecem alimentos e meios de subsistência para milhões de pessoas. Durante décadas, produtores e cientistas confiaram na seleção genética, esperando que a natureza produzisse animais com melhores características, ou utilizando tecnologias reprodutivas para multiplicar a descendência dos melhores desempenhos. No entanto, esse processo é lento e limitado pela variação genética já presente no rebanho. Uma ferramenta mais recente, conhecida como edição genômica, oferece uma maneira de fazer mudanças precisas no código genético de um animal, potencialmente introduzindo características desejáveis muito mais rápido do que os métodos tradicionais conseguiriam. Um gene específico, que atua como um freio natural ao crescimento muscular, tornou-se um alvo principal para essa tecnologia. Quando esse freio é afrouxado ou removido, os animais desenvolvem mais músculos, uma característica altamente valiosa para a produção de carne. O desafio reside em entregar as ferramentas de edição nos estágios iniciais da vida sem prejudicar o embrião delicado, uma tarefa que exige um equilíbrio entre precisão e delicadeza.

Uma equipe de pesquisadores do Instituto Central de Pesquisa sobre Cabras na Índia deu um passo significativo para resolver esse desafio ao combinar duas técnicas estabelecidas: um método para coletar muitos embriões de uma só vez e uma forma de entregar ferramentas genéticas neles sem cirurgia invasiva. Os pesquisadores focaram no gene da miostatina, o regulador natural que limita o tamanho do músculo em cabras. O objetivo deles era ver se conseguiam desativar temporariamente esse gene em embriões de cabra logo após a fertilização, usando uma ferramenta molecular que atua como uma tesoura para cortar o DNA em um ponto específico. Para fazer isso, utilizaram uma técnica chamada eletroporação, que usa pulsos elétricos breves e controlados para abrir pequenos buracos temporários na membrana celular, permitindo que as ferramentas de edição deslizem para o interior. Essa abordagem evita a necessidade de injetar cada embrião individualmente com uma agulha, um processo que é difícil e demorado quando se lida com muitos embriões ao mesmo tempo.

O estudo começou com oito cabras fêmeas que foram tratadas com hormônios para produzir vários óvulos ao mesmo tempo, um processo conhecido como superovulação. Os pesquisadores coletaram setenta e oito óvulos fertilizados, ou zigotos presumidos, desses animais por meio de um procedimento cirúrgico minimamente invasivo. Esses minúsculos embriões foram então colocados em uma solução contendo as ferramentas de edição genética, que consistiam em uma proteína e uma molécula guia projetada para encontrar o gene da miostatina. O grupo foi submetido a três pulsos elétricos curtos, cada um durando três milissegundos, para ajudar as ferramentas a entrar nas células. Após o tratamento elétrico, os embriões foram devolvidos a um ambiente quente e controlado para crescer. Notavelmente, todos os setenta e oito embriões se desenvolveram até o estágio de mórula em cultura, com dois deles progredindo ainda mais para se tornarem blastocistos, um estágio de desenvolvimento mais avançado.

Para verificar se a edição realmente funcionou, os cientistas examinaram quatro embriões no estágio de mórula. Eles extraíram o material genético dessas células e procuraram por sinais de que o gene da miostatina havia sido cortado e reparado com erros, que é como o gene é desativado. A análise mostrou que três de quatro embriões, ou 75 por cento, carregavam a mudança genética pretendida. Isso confirmou que o método elétrico entregou com sucesso as ferramentas de edição e que as ferramentas funcionaram corretamente dentro das células em desenvolvimento. Os pesquisadores então passaram para a próxima fase crítica: ver se esses embriões editados poderiam crescer até se tornarem um feto dentro de uma cabra mãe. Eles selecionaram quatro embriões que haviam atingido o estágio de quatro células e os transferiram para uma única cabra fêmea que havia sido sincronizada para estar pronta para a gravidez.

A transferência foi bem-sucedida. A cabra receptora engravidou, e exames de ultrassom confirmaram a presença de fetos saudáveis com corações batendo. Infelizmente, a cabra mãe morreu de pneumonia aos cinquenta e sete dias de gestação, muito antes de a gravidez atingir o termo completo. No entanto, os pesquisadores conseguiram recuperar dois fetos intactos do útero. Ambos os fetos pareciam normais em forma e tamanho, sem sinais visíveis de problemas de desenvolvimento, sugerindo que o processo de edição não prejudicou seu crescimento. A equipe então testou o material genético das orelhas desses dois fetos para ver se o gene da miostatina havia sido editado. Os resultados mostraram que um dos fetos, um macho, carregava a modificação genética, enquanto a fêmea não. Esse resultado destaca que, mesmo quando os embriões recebem o mesmo tratamento, a edição pode ocorrer em alguns mas não em outros, uma variação conhecida neste tipo de ciência.

Este trabalho demonstra que é possível combinar a coleta de múltiplos embriões de um doador com um método de entrega elétrica não invasivo para editar o genoma de cabras. O estudo prova que os embriões podem sobreviver aos pulsos elétricos, continuar se desenvolvendo em laboratório e serem implantados com sucesso em uma receptora para crescerem como fetos. Embora a edição não tenha sido bem-sucedida em todos os casos, o fato de a modificação ter sido detectada tanto nos embriões iniciais cultivados em laboratório quanto em um feto que se desenvolveu dentro de uma mãe mostra que a abordagem é viável. Os pesquisadores estabeleceram um fluxo de trabalho que liga a recuperação de embriões de um doador valioso, a aplicação da edição genômica e a transferência desses embriões para uma mãe substituta. Esta plataforma integrada fornece uma base para esforços futuros de criar cabras com crescimento muscular aprimorado, oferecendo um caminho mais eficiente para melhorar as características do gado do que apenas a reprodução tradicional.