MOET-assisted CRISPR/Cas9-mediated MSTN genome editing in caprine embryos by electroporation and embryo transfer

In der Welt der Nutztierhaltung war das Ziel seit langem, die Tiere zu verbessern, die Nahrung und Lebensgrundlagen für Millionen von Menschen bereitstellen. Jahrzehntelang haben sich Landwirte und Wissenschaftler auf die selektive Zucht verlassen, indem sie darauf warteten, dass die Natur Tiere mit besseren Eigenschaften hervorbringt, oder sie nutzten Reproduktionstechnologien, um die Nachkommen der besten Leistenden zu vervielfältigen. Dieser Prozess ist jedoch langsam und durch die bereits in der Herde vorhandene genetische Variation begrenzt. Ein neueres Werkzeug, bekannt als Genom-Editierung, bietet eine Möglichkeit, präzise Änderungen am genetischen Code eines Tieres vorzunehmen, was potenziell dazu führen kann, dass wünschenswerte Merkmale viel schneller eingeführt werden, als dies mit traditionellen Methoden möglich wäre. Ein spezifisches Gen, das wie eine natürliche Bremse für das Muskelwachstum wirkt, ist zu einem primären Ziel dieser Technologie geworden. Wenn diese Bremse gelockert oder entfernt wird, entwickeln die Tiere mehr Muskeln – ein Merkmal, das für die Fleischproduktion äußerst wertvoll ist. Die Herausforderung besteht darin, die Editierungswerkzeuge in die frühesten Stadien des Lebens einzubringen, ohne das empfindliche Embryo zu schädigen, eine Aufgabe, die ein Gleichgewicht zwischen Präzision und Sanftheit erfordert.

Ein Team von Forschern am Central Institute for Research on Goats in Indien hat einen bedeutenden Schritt zur Lösung dieser Herausforderung unternommen, indem es zwei etablierte Techniken kombinierte: eine Methode zur gleichzeitigen Sammlung vieler Embryonen und eine Methode zur Verabreichung genetischer Werkzeuge in diese, ohne dass ein invasiver chirurgischer Eingriff erforderlich ist. Die Forscher konzentrierten sich auf das Myostatin-Gen, den natürlichen Regulator, der die Muskelgröße bei Ziegen begrenzt. Ihr Ziel war es zu sehen, ob sie dieses Gen unmittelbar nach der Befruchtung in Ziegenembryonen vorübergehend deaktivieren könnten, indem sie ein molekulares Werkzeug verwendeten, das wie eine Schere fungiert, um die DNA an einer spezifischen Stelle zu schneiden. Hierzu verwendeten sie eine Technik namens Elektroporation, bei der kurze, kontrollierte elektrische Impulse verwendet werden, um winzige, temporäre Löcher in der Zellmembran zu öffnen, damit die Editierungswerkzeuge hineingleiten können. Dieser Ansatz vermeidet die Notwendigkeit, jedes Embryo einzeln mit einer Nadel zu injizieren, ein Prozess, der schwierig und zeitaufwendig ist, wenn man mit vielen Embryonen gleichzeitig arbeitet.

Die Studie begann mit acht Ziegenweibchen, die mit Hormonen behandelt wurden, um gleichzeitig mehrere Eizellen zu produzieren, ein Prozess, der als Superovulation bekannt ist. Die Forscher sammelten achtundsiebzig befruchtete Eier, oder presumptive Zygote, von diesen Tieren mittels eines minimalinvasiven chirurgischen Verfahrens. Diese winzigen Embryonen wurden dann in eine Lösung gelegt, die die genetischen Editierungswerkzeuge enthielt, bestehend aus einem Protein und einem Leitmolekül, das darauf ausgelegt ist, das Myostatin-Gen zu finden. Die Gruppe wurde drei kurzen elektrischen Pulsen ausgesetzt, von denen jeder drei Millisekunden dauerte, um den Werkzeugen den Eintritt in die Zellen zu ermöglichen. Nach der elektrischen Behandlung wurden die Embryonen in eine warme, kontrollierte Umgebung zurückgebracht, um zu wachsen. Bemerkenswerterweise entwickelten sich alle achtundsiebzig Embryonen in der Kultur bis zum Morula-Stadium, wobei zwei von ihnen sich weiterentwickelten und zu Blastozysten wurden, einem fortgeschritteneren Entwicklungsstadium.

Um zu überprüfen, ob die Editierung tatsächlich funktioniert hatte, untersuchten die Wissenschaftler vier der Morula-Stadium-Embryonen. Sie extrahierten das genetische Material aus diesen Zellen und suchten nach Anzeichen dafür, dass das Myostatin-Gen geschnitten und mit Fehlern repariert worden war, was die Art und Weise ist, wie das Gen deaktiviert wird. Die Analyse zeigte, dass drei von den vier Embryonen, also 75 Prozent, die beabsichtigte genetische Veränderung aufwiesen. Dies bestätigte, dass die elektrische Methode die Editierungswerkzeuge erfolgreich lieferte und dass die Werkzeuge innerhalb der sich entwickelnden Zellen korrekt funktionierten. Die Forscher gingen dann zur nächsten kritischen Phase über: zu sehen, ob diese editierten Embryonen in einer Ziegenmutter zu einem Fötus heranwachsen konnten. Sie wählten vier Embryonen aus, die das Vier-Zell-Stadium erreicht hatten, und transferierten sie in ein einzelnes Ziegenweibchen, das synchronisiert worden war, um bereit für eine Trächtigkeit zu sein.

Der Transfer war erfolgreich. Das Empfängerweibchen wurde trächtig, und Ultraschalluntersuchungen bestätigten die Anwesenheit gesunder Föten mit schlagenden Herzen. Leider verstarb die Mutterziege mit siebenundfünfzig Tagen Gestationsdauer an Lungenentzündung, lange bevor die Trächtigkeit den Volltermin erreichen konnte. Die Forscher konnten jedoch zwei intakte Föten aus dem Uterus bergen. Beide Föten erschienen in Form und Größe normal, ohne sichtbare Anzeichen von Entwicklungsstörungen, was darauf hindeutet, dass der Editierungsprozess ihr Wachstum nicht beeinträchtigt hat. Das Team testete dann das genetische Material aus den Ohren dieser beiden Föten, um zu sehen, ob das Myostatin-Gen editiert worden war. Die Ergebnisse zeigten, dass einer der Föten, ein Männchen, die genetische Modifikation trug, während das Weibchen dies nicht tat. Dieses Ergebnis unterstreicht, dass selbst wenn Embryonen der gleichen Behandlung unterzogen werden, die Editierung in einigen, aber nicht in anderen stattfinden kann, was eine bekannte Variation in dieser Art der Wissenschaft ist.

Diese Arbeit zeigt, dass es möglich ist, die Sammlung mehrerer Embryonen von einem Spendertier mit einer nicht-invasiven elektrischen Liefermethode zur Genom-Editierung von Ziegen zu kombinieren. Die Studie beweist, dass die Embryonen die elektrischen Impulse überleben können, im Labor weiterentwickelt werden können und erfolgreich in einen Empfänger implantiert werden können, um zu Föten heranzuwachsen. Obwohl die Editierung nicht in jedem einzelnen Fall erfolgreich war, zeigt die Tatsache, dass die Modifikation sowohl in den frühen im Labor gezüchteten Embryonen als auch in einem Fötus, der sich in einer Mutter entwickelte, nachgewiesen wurde, dass der Ansatz lebensfähig ist. Die Forscher haben einen Arbeitsablauf etabliert, der die Gewinnung von Embryonen von einem wertvollen Spender, die Anwendung der Genom-Editierung und den Transfer dieser Embryonen an eine Ersatzmutter verknüpft. Diese integrierte Plattform bietet eine Grundlage für zukünftige Bemühungen zur Erschaffung von Ziegen mit verbessertem Muskelwachstum und bietet einen effizienteren Weg zur Verbesserung von Nutztiermerkmalen als die traditionelle Zucht allein.