MOET-assisted CRISPR/Cas9-mediated MSTN genome editing in caprine embryos by electroporation and embryo transfer

पशुपालन की दुनिया में, लक्ष्य लंबे समय से उन जानवरों में सुधार करना रहा है जो लाखों लोगों को भोजन और आजीविका प्रदान करते हैं। दशकों से, किसान और वैज्ञानिक चयनात्मक प्रजनन (selective breeding) पर भरोसा करते आए हैं, इस प्रतीक्षा में कि प्रकृति बेहतर गुणों वाले जानवरों को जन्म दे, या सर्वोत्तम प्रदर्शन करने वाले पशुओं की संतान को बढ़ाने के लिए प्रजनन तकनीकों का उपयोग करते हैं। हालाँकि, यह प्रक्रिया धीमी है और झुंड में पहले से मौजूद आनुवंशिक भिन्नता तक सीमित है। एक नया उपकरण, जिसे जीनोम एडिटिंग (genome editing) के रूप में जाना जाता है, जानवर के आनुवंशिक कोड में सटीक परिवर्तन करने का एक तरीका प्रदान करता है, जो पारंपरिक तरीकों की तुलना में वांछित गुणों को बहुत तेज़ी से पेश कर सकता है। एक विशिष्ट जीन, जो मांसपेशियों के विकास पर एक प्राकृतिक ब्रेक के रूप में कार्य करता है, इस तकनीक के लिए एक प्राथमिक लक्ष्य बन गया है। जब इस ब्रेक को ढीला या हटा दिया जाता है, तो जानवरों में अधिक मांसपेशियां विकसित होती हैं, जो मांस उत्पादन के लिए एक अत्यधिक मूल्यवान गुण है। चुनौती जीवन के शुरुआती चरणों में एडिटिंग टूल्स को बिना नाजुक भ्रूण को नुकसान पहुँचाए पहुँचाने में निहित है, जो सटीकता और कोमलता के बीच संतुलन की मांग करता है।

भारत में 'सेंट्रल इंस्टीट्यूट फॉर रिसर्च ऑन गोट्स' के शोधकर्ताओं की एक टीम ने दो स्थापित तकनीकों को जोड़कर इस चुनौती को हल करने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम उठाया है: एक विधि जिससे एक साथ कई भ्रूण एकत्र किए जा सकते हैं और एक तरीका जिससे बिना किसी आक्रामक सर्जरी के आनुवंशिक उपकरणों को उनमें पहुँचाया जा सके। शोधकर्ताओं ने मायोस्टैटिन (myostatin) जीन पर ध्यान केंद्रित किया, जो बकरियों में मांसपेशियों के आकार को नियंत्रित करने वाला प्राकृतिक नियामक है। उनका लक्ष्य यह देखना था कि क्या वे निषेचन के तुरंत बाद बकरी के भ्रूणों में इस जीन को अस्थायी रूप से अक्षम कर सकते हैं, जिसके लिए एक आणविक उपकरण का उपयोग किया गया जो डीएनए को एक विशिष्ट स्थान पर काटने के लिए कैंची की तरह काम करता है। ऐसा करने के लिए, उन्होंने इलेक्ट्रोपोरेशन (electroporation) नामक तकनीक का उपयोग किया, जो कोशिका झिल्ली में छोटे, अस्थायी छेद खोलने के लिए नियंत्रित विद्युत स्पंदों (electrical pulses) का उपयोग करती है, जिससे एडिटिंग टूल्स अंदर फिसल सकें। यह दृष्टिकोण प्रत्येक भ्रूण में व्यक्तिगत रूप से सुई के माध्यम से इंजेक्शन लगाने की आवश्यकता को समाप्त करता है, जो कई भ्रूणों के साथ काम करते समय एक कठिन और समय लेने वाली प्रक्रिया है।

अध्ययन की शुरुआत आठ मादा बकरियों के साथ हुई जिन्हें एक ही समय में कई अंडे उत्पन्न करने के लिए हार्मोन दिए गए थे, जिसे सुपरओव्यूलेशन (superovulation) कहा जाता है। शोधकर्ताओं ने इन जानवरों से एक न्यूनतम आक्रामक सर्जिकल प्रक्रिया का उपयोग करके अठहत्तर निषेचित अंडों, या संभावित युग्मज (presumptive zygotes) को एकत्र किया। इन सूक्ष्म भ्रूणों को फिर एक घोल में रखा गया जिसमें आनुवंशिक एडिटिंग टूल्स शामिल थे, जिसमें एक प्रोटीन और एक मार्गदर्शक अणु (guide molecule) था जिसे मायोस्टैटिन जीन को खोजने के लिए डिज़ाइन किया गया था। समूह को तीन छोटे विद्युत स्पंदों के अधीन किया गया, जिनमें से प्रत्येक तीन मिलीसेकंड का था, ताकि टूल्स को कोशिकाओं के भीतर प्रवेश करने में मदद मिल सके। विद्युत उपचार के बाद, भ्रूणों को विकसित होने के लिए एक गर्म, नियंत्रित वातावरण में वापस भेज दिया गया। उल्लेखनीय रूप से, सभी अठहत्तर भ्रूण प्रयोगशाला संस्कृति में मोरुला (morula) अवस्था तक विकसित हुए, जिनमें से दो आगे बढ़कर ब्लास्टोसिस्ट (blastocyst) बन गए, जो विकास का एक अधिक उन्नत चरण है।

यह सत्यापित करने के लिए कि एडिटिंग वास्तव में सफल रही है या नहीं, वैज्ञानिकों ने चार मोरुला-चरण के भ्रूणों का परीक्षण किया। उन्होंने इन कोशिकाओं से आनुवंशिक सामग्री निकाली और इस बात के संकेतों की तलाश की कि मायोस्थैटिन जीन को काटा गया है और त्रुटियों के साथ मरम्मत की गई है, क्योंकि इसी तरह से जीन को अक्षम किया जाता है। विश्लेषण से पता चला कि चार में से तीन भ्रूणों, या 75 प्रतिशत में, इच्छित आनुवंशिक परिवर्तन मौजूद थे। इसने पुष्टि की कि विद्युत विधि ने सफलतापूर्वक एडिटिंग टूल्स को पहुँचाया और टूल्स ने विकसित होती कोशिकाओं के भीतर सही ढंग से कार्य किया। शोधकर्ता फिर अगले महत्वपूर्ण चरण की ओर बढ़े: यह देखना कि क्या ये संपादित भ्रूण एक मादा बकरी के भीतर एक भ्रूण (fetus) के रूप में विकसित हो सकते हैं। उन्होंने चार भ्रूणों को चुना जो चार-कोशिका अवस्था तक पहुँच चुके थे और उन्हें एक एकल मादा बकरी में स्थानांतरित कर दिया गया, जिसे गर्भधारण के लिए तैयार होने के लिए सिंक्रोनाइज़ किया गया था।

स्थानांतरण सफल रहा। प्राप्तकर्ता बकरी गर्भवती हो गई, और अल्ट्रासाउंड स्कैन ने धड़कते दिलों के साथ स्वस्थ भ्रूणों की उपस्थिति की पुष्टि की। दुर्भाग्य से, माँ की गर्भधारण के सत्तावन दिनों के भीतर निमोनिया से मृत्यु हो गई, जो पूर्ण अवधि तक पहुँचने से बहुत पहले था। हालाँकि, शोधकर्ता गर्भाशय से दो पूर्ण भ्रूणों को निकालने में सक्षम रहे। दोनों भ्रूण सामान्य आकार और आकृति के दिखाई दिए, जिनमें विकासात्मक समस्याओं के कोई दृश्य संकेत नहीं थे, जिससे पता चलता है कि एडिटिंग प्रक्रिया ने उनके विकास को नुकसान नहीं पहुँचाया। टीम ने इन दो भ्रूणों के कान के आनुवंशिक पदार्थ का परीक्षण किया ताकि यह देखा जा सके कि क्या मायोस्टैटिन जीन को संपादित किया गया था। परिणामों ने दिखाया कि एक भ्रूण, जो एक नर था, उसमें आनुवंशिक संशोधन मौजूद था, जबकि मादा में यह नहीं था। यह परिणाम इस बात को रेखांकित करता है कि भले ही भ्रूणों को एक ही उपचार दिया जाए, फिर भी एडिटिंग कुछ में हो सकती है और दूसरों में नहीं, जो इस प्रकार के विज्ञान में एक ज्ञात भिन्नता है।

यह कार्य यह प्रदर्शित करता है कि एक दाता से कई भ्रूणों के संग्रह को गैर-आक्रामक विद्युत वितरण पद्धति के साथ जोड़ना संभव है। अध्ययन सिद्ध करता है कि भ्रूण विद्युत स्पंदों को झेल सकते हैं, प्रयोगशाला में विकसित होना जारी रख सकते हैं, और एक प्राप्तकर्ता में प्रत्यारोपित होकर भ्रूण के रूप में विकसित हो सकते हैं। हालांकि एडिटिंग हर एक मामले में सफल नहीं रही, लेकिन तथ्य यह है कि संशोधन को प्रारंभिक लैब-ग्रोन भ्रूणों और एक भ्रूण दोनों में पाया गया जो एक माँ के भीतर विकसित हुआ, यह दर्शाता है कि यह दृष्टिकोण व्यवहार्य है। शोधकर्ताओं ने एक वर्कफ़्लो स्थापित किया है जो एक मूल्यवान दाता से भ्रूणों की प्राप्ति, जीनोम एडिटिंग के अनुप्रयोग और उन भ्रूणों को एक सरोगेट माँ में स्थानांतरित करने को जोड़ता है। यह एकीकृत मंच उन्नत मांसपेशी विकास वाली बकरियों को बनाने के भविष्य के प्रयासों के लिए एक आधार प्रदान करता है, जो पारंपरिक प्रजनन के अकेले मुकाबले पशुओं के गुणों को सुधारने का एक अधिक कुशल मार्ग प्रदान करता है।