MOET-assisted CRISPR/Cas9-mediated MSTN genome editing in caprine embryos by electroporation and embryo transfer

家畜農業の世界において、長年の目標は、何百万人もの人々に食料と生計を提供している動物を改良することでした。何十年もの間、農家や科学者は、より優れた形質を持つ動物が自然に生まれるのを待つか、あるいは優れた個体の次世代を増やすために繁殖技術に頼ってきました。しかし、このプロセスは遅く、すでに群れの中に存在する遺伝的な多様性に制限されています。ゲノム編集として知られる新しいツールは、動物の遺伝コードに対して精密な変更を加える方法を提供し、伝統的な手法よりもはるかに速く望ましい形質を導入できる可能性があります。筋肉の成長を抑える天然のブレーキとして機能する特定の遺伝子が、この技術の主要な標的となっています。このブレーキが緩められたり取り除かれたりすると、動物はより多くの筋肉を発達させますが、これは食肉生産において非常に価値の高い形質です。課題は、デリケートな胚を傷つけることなく、生命の最も初期の段階に編集ツールを届けることであり、この作業には精密さと優しさの両立が求められます。

インドの中央山羊研究研究所のチームは、二つの確立された技術を組み合わせることで、この課題の解決に向けた重要な一歩を踏み出しました。それは、多くの胚を一度に回収する方法と、侵襲的な手術を行わずに遺伝子ツールを胚に届ける方法を組み合わせるというものです。研究者たちは、ヤギの筋肉のサイズを制限する天然の調節因子であるミオスタチン遺伝子に焦に焦点を当てました。彼らの目的は、DNAの特定の箇所を切断する「ハサミ」のように機能する分子ツールを用いて、受精直後のヤギの胚において、この遺伝子を一時的に機能停止させることができるかどうかを確認することでした。これを行うために、彼らはエレクトロポレーションと呼ばれる技術を用いました。これは、制御された短い電気パルスを使用して細胞膜に微細で一時的な穴を開け、編集ツールを内部に滑り込ませる手法です。このアプローチにより、多数の胚を扱う際に困難で時間がかかる、一本一本の胚に針で注入するという作業を回避することができます。

研究は、複数の卵を同時に産生させるためにホルモン処理を施した8頭の雌のヤギから始まりました。これは過排卵と呼ばれるプロセスです。研究者たちは、これらの動物から最小限の侵襲的な外科的手法を用いて、78個の受精卵（すなわち接合子）を回収しました。これらの小さな胚は、タンパク質とミオスタチン遺伝子を見つけ出すように設計されたガイド分子からなる溶液に入れられました。グループ全体には、細胞内にツールを浸透させるために、それぞれ3ミリ秒間の3回の短い電気パルスが照射されました。電気処理の後、胚は成長のために温暖で制御された環境に戻されました。驚くべきことに、78個の胚すべてが培養下でモルラ（桑実胚）期まで発達し、そのうち2個はさらに進んだ段階であるブラストシスト（胞胚）へと進行しました。

編集が実際に機能したことを検証するため、科学者たちは4つのモルラ期の胚を検査しました。彼らはこれらの細胞から遺伝物質を抽出し、ミオスタチン遺伝子が切断され、エラーを伴って修復されている（これが遺伝子を無効化する方法です）兆候を探しました。分析の結果、4個中3個の胚（75パーセント）が意図した遺伝子変化を保持していることが示されました。これにより、電気的な手法が編集ツールを正常に届け、ツールが発達中の細胞内で正しく機能したことが確認されました。研究者たちは次に、極めて重要な段階、すなわち、これらの編集された胚が母ヤギの中で胎児へと成長できるかどうかを確認する段階へと進みました。彼らは4細胞期に達した4つの胚を選び、妊娠の準備が整うよう同期させた1頭の雌のヤギへと移植しました。

移植は成功しました。受け入れ側のヤギは妊娠し、超音波検査によって、心臓が鼓動している健康な胎児の存在が確認されました。残念ながら、母ヤギは妊娠期間の57日目に肺炎のため死亡し、妊娠満了には遠く及びませんでした。しかし、研究者たちは子宮から2体の完全な胎児を回収することができました。両方の胎児は形状や大きさにおいて正常に見え、発達上の問題を示す目立った兆候もなかったことから、編集プロセスが彼らの成長を損なわなかったことが示唆されました。チームは、これら2体の胎児の耳から遺伝物質をテストし、ミオスタチン遺伝子が編集されているかどうかを確認しました。結果は、一方の胎児（オス）は遺伝子改変を保持していた一方で、もう一方（メス）は保持していなかったことを示しました。この結果は、たとえ胚が同じ処理を受けても、編集が起こるものと起こらないものがあるという、この種の科学における既知の変動を浮き彫りにしています。

この研究は、ドナーからの複数の胚の回収と、非侵襲的な電気的デリバリー法を組み合わせることで、ヤギのゲノム編集が可能であることを証明しています。本研究は、胚が電気パルスに耐え、ラボ内で成長を続け、受け入れ個体の中に移植されて胎児として成長できることを示しています。編集がすべてのケースで成功したわけではありませんが、ラボで育てられた初期の胚と、母ヤギの中で発達した胎児の両方で改変が検出されたことは、このアプローチが実行可能であることを示しています。研究者たちは、貴重なドナーからの胚の回収、ゲノム編集の適用、そしてそれらの胚を代理母へ移植するという一連のワークフローを確立しました。この統合されたプラットフォームは、従来の育種単独よりも効率的な方法で、筋肉の成長を強化したヤギを作り出すための将来的な取り組みへの基礎を提供します。