MOET-assisted CRISPR/Cas9-mediated MSTN genome editing in caprine embryos by electroporation and embryo transfer

Nel mondo dell'allevamento di bestiame, l'obiettivo è da tempo quello di migliorare gli animali che forniscono cibo e mezzi di sussistenza a milioni di persone. Per decenni, agricoltori e scienziati si sono affidati alla selezione genetica, aspettando che la natura producesse animali con tratti migliori, o utilizzando tecnologie riproduttive per moltiplicare la prole dei soggetti con le prestazioni migliori. Tuttavia, questo processo è lento e limitato dalla variazione genetica già presente nella mandria. Uno strumento più recente, noto come editing genomico, offre un modo per apportare modifiche precise al codice genetico di un animale, introducendo potenzialmente tratti desiderabili molto più velocemente di quanto possano fare i metodi tradizionali. Un gene specifico, che agisce come un freno naturale alla crescita muscolare, è diventato un obiettivo primario per questa tecnologia. Quando questo freno viene allentato o rimosso, gli animali sviluppano più muscoli, un tratto altamente prezioso per la produzione di carne. La sfida risiede nel consegnare gli strumenti di editing nelle prime fasi della vita senza danneggiare l'embrione delicato, un compito che richiede un equilibrio tra precisione e delicatezza.

Un team di ricercatori presso l'Istituto Centrale per la Ricerca sulle Capre in India ha compiuto un passo significativo verso la risoluzione di questa sfida combinando due tecniche consolidate: un metodo per raccogliere molti embrioni contemporaneamente e un modo per consegnare gli strumenti genetici in essi senza chirurgia invasiva. I ricercatori si sono concentrati sul gene della miostatina, il regolatore naturale che limita la dimensione muscolare nelle capre. Il loro obiettivo era vedere se fossero in grado di disattivare temporaneamente questo gene negli embrioni di capra subito dopo la fecondazione, utilizzando uno strumento molecolare che agisce come un paio di forbici per tagliare il DNA in un punto specifico. Per farlo, hanno utilizzato una tecnica chiamata elettroporazione, che utilizza impulsi elettrici brevi e controllati per aprire minuscoli fori temporanei nella membrana cellulare, permettendo agli strumenti di editing di scivolare all'interno. Questo approccio evita la necessità di iniettare ogni singolo embrione con un ago, un processo difficile e lungo quando si trattano molti embrioni contemporaneamente.

Lo studio è iniziato con otto capre femmine che sono state trattate con ormoni per produrre più uova contemporaneamente, un processo noto come superovulazione. I ricercatori hanno raccolto settantotto uova fertilizzate, o zigoti presuntivi, da questi animali utilizzando una procedura chirurgica minimamente invasiva. Questi minuscoli embrioni sono stati poi posti in una soluzione contenente gli strumenti di editing genetico, che consistevano in una proteina e una molecola guida progettata per trovare il gene della miostatina. Il gruppo è stato sottoposto a tre brevi impulsi elettrici, ciascuno della durata di tre millisecondi, per aiutare gli strumenti a entrare nelle cellule. Dopo il trattamento elettrico, gli embrioni sono stati riportati in un ambiente caldo e controllato per crescere. Sorprendentemente, tutti i settantotto embrioni si sono sviluppati fino allo stadio di morula in coltura, con due di essi che sono progrediti ulteriormente diventando blastocisti, uno stadio di sviluppo più avanzato.

Per verificare che l'editing avesse effettivamente funzionato, gli scienziati hanno esaminato quattro embrioni allo stadio di morula. Hanno estratto il materiale genetico da queste cellule e hanno cercato segni del fatto che il gene della miostatina fosse stato tagliato e riparato con errori, che è il modo in cui il gene viene disattivato. L'analisi ha mostrato che tre degli quattro embrioni, ovvero il 75 percento, portavano la modifica genetica prevista. Ciò ha confermato che il metodo elettrico aveva consegnato con successo gli strumenti di editing e che gli strumenti funzionavano correttamente all'interno delle cellule in via di sviluppo. I ricercatori sono poi passati alla fase successiva e critica: vedere se questi embrioni potessero crescere in un feto all'interno di una capra madre. Hanno selezionato quattro embrioni che avevano raggiunto lo stadio di quattro cellule e li hanno trasferiti in una singola capra femmina che era stata sincronizzata per essere pronta per la gravidanza.

Il trasferimento è stato un successo. La capra ricevente è rimasta incinta e le scansioni ecografiche hanno confermato la presenza di feti sani con cuori battenti. Sfortunatamente, la capra madre è morta di polmonite a cinquantasette giorni di gestazione, ben prima che la gravidanza potesse raggiungere il termine completo. Tuttavia, i ricercatori sono stati in grado di recuperare due feti intatti dall'utero. Entrambi i feti apparivano normali per forma e dimensione, senza segni visibili di problemi di sviluppo, suggerendo che il processo di editing non avesse danneggiato la loro crescita. Il team ha poi testato il materiale genetico dalle orecchie di questi due feti per vedere se il gene della miostatina fosse stato modificato. I risultati hanno mostrato che uno dei feti, un maschio, portava la modifica genetica, mentre la femmina no. Questo risultato evidenzia che anche quando gli embrioni ricevono lo stesso trattamento, l'editing può avvenire in alcuni ma non in altri, una variazione nota in questo tipo di scienza.

Questo lavoro dimostra che è possibile combinare la raccolta di più embrioni da un donatore con un metodo di consegna elettrica non invasivo per modificare il genoma delle capre. Lo studio prova che gli embrioni possono sopravvivere agli impulsi elettrici, continuare a svilupparsi in laboratorio e impiantarsi con successo in una ricevente per crescere in feti. Sebbene l'editing non sia stato efficace in ogni singolo caso, il fatto che la modifica sia stata rilevata sia nei primi embrioni coltivati in laboratorio che in un feto sviluppatosi all'interno di una madre, mostra che l'approccio è praticabile. I ricercatori hanno stabilito un flusso di lavoro che collega il recupero degli embrioni da un donatore prezioso, l'applicazione dell'editing genomico e il trasferimento di tali embrioni a una madre surrogata. Questa piattaforma integrata fornisce una base per futuri sforzi volti a creare capre con una crescita muscolare potenziata, offrendo una via più efficiente per migliorare i tratti del bestiame rispetto alla selezione tradizionale da sola.