Enhanced production of cis-13,16-docosadienoic acid in Yarrowia lipolytica via systematic metabolic engineering

Tief in der mikroskopischen Welt der einzelligen Pilze hat die Natur komplizierte Fabriken erschaffen, die in der Lage sind, komplexe Moleküle aus einfachen Zutaten wie Zucker zusammenzusetzen. Zu diesen Molekülen gehören Fettsäuren, die Bausteine von Ölen und Fetten, die eine entscheidende Rolle sowohl für die menschliche Gesundheit als auch für die natürliche Welt spielen. Einige dieser Fettsäuren, bekannt als mehrfach ungesättigte Fette, sind besonders wertvoll, da der menschliche Körper sie nicht selbst herstellen kann; wir müssen sie über unsere Nahrung aufnehmen. Ein solches Molekül, eine Kette aus zweiundzwanzig Kohlenstoffatomen namens cis-13,16-Docosadienonsäure, hat vor kurzem die Aufmerksamkeit von Wissenschaftlern auf sich gezogen. Die Forschung deutet darauf hin, dass dieses spezifische Fett über starke Eigenschaften verfügt, einschließlich der Fähigkeit, das Wachstum bestimmter Krebszellen zu verlangsamen und Entzündungen zu bekämpfen. Bis jetzt war die Gewinnung dieser Substanz eine schwierige Aufgabe. Sie kommt in der Natur nur in den Samen einer seltenen Winterpflanze vor, die langsam wächst und schwer in großen Mengen kultiviert werden kann. Chemische Methoden, um sie im Labor herzustellen, sind ebenso anspruchsvoll und beinhalten komplizierte Schritte sowie hohe Kosten. Dies hat Forscher auf der Suche nach einem besseren Weg zur Herstellung dazu bewogen, ihre Augen auf die Hefe Yarrowia lipolytica zu richten, einen robusten Mikroorganismus, der für seine Fähigkeit bekannt ist, Öle anzureichern.

Die Herausforderung besteht darin, diese Hefe davon zu überzeugen, ein Molekül herzustellen, das sie von Natur aus nicht produziert. Die Hefe ist bereits recht gut darin, einen Vorläufer namens Linolsäure herzustellen, aber ihr fehlen die spezifischen Werkzeuge, um diesen Vorläufer zu der längeren, komplexeren Kette zu dehnen, die für das Endprodukt erforderlich ist. Um dies zu lösen, behandelte ein Team von Forschern der Hunan Agricultural University und anderer Institutionen die Hefe wie eine biologische Werkstatt und fügte systematisch die genetischen Werkzeuge hinzu und passte diese an, die für die Vollendung des Jobs benötigt wurden. Sie begannen damit, sicherzustellen, dass die Werkstatt über einen reichlichen Vorrat an Ausgangsmaterial verfügte. Durch die Einführung von Genen aus anderen Organismen, die als spezialisierte Konverter fungieren, gelang es ihnen erfolgreich, die Menge der Linolsäure innerhalb der Hefezellen zu erhöhen. Dieser Schritt war entscheidend, da ein Mangel an Rohmaterial oft die gesamte Produktionslinie ausbremst.

Nachdem die Versorgung mit Rohmaterial gesichert war, wandte das Team seine Aufmerksamkeit der Montagestraße zu. Die Umwandlung des Vorläufers in das Endprodukt erfordert einen zweistufigen Dehnungsprozess. Die Forscher testeten verschiedene Versionen der Enzyme, die für dieses Dehnen verantwortlich sind, ganz ähnlich wie man verschiedene Werkzeuge ausprobiert, um zu sehen, welches am besten für die Aufgabe geeignet ist. Sie fanden heraus, dass eine bestimmte Enzymkombination deutlich besser funktionierte als andere und die Fettsäurekette erfolgreich verlängerte. Dennoch war der Prozess noch nicht effizient genug. Die Hefe produzierte zwar den Zwischenschritt der Kette, hatte aber Schwierigkeiten, den Job zu vollenden. Um dies zu beheben, versuchten die Wissenschaftler eine Technik namens Enzymfusion, bei der sie zwei der notwendigen Enzyme physisch miteinander verbanden, in der Hoffnung, dass dies den Materialtransfer zwischen ihnen reibungsloser machen würde. Überraschenderweise funktionierte dieser Ansatz nicht wie erwartet. Die verknüpften Enzyme schienen sich gegenseitig im Weg zu stehen, und die Produktion des Endprodukts verbesserte sich nicht. Dieses Ergebnis lehrte das Team, dass das bloße Zusammenstecken von Werkzeugen sie nicht immer besser arbeiten lässt; manchmal zählt die Anordnung mehr als die Verbindung.

Unbeirrt verlagerten die Forscher ihre Strategie auf die Kraft der Anweisungen, die diese Enzyme steuern. Sie erhöhten die Anzahl der Kopien der Gene, die für den Dehnungsprozess verantwortlich sind, und testeten verschiedene genetische Schalter, sogenannte Promotoren, um zu kontrollieren, wie stark diese Gene aktiviert werden. In einer kontraintuitiven Entdeckung stellten sie fest, dass ein schwächerer Schalter tatsächlich bessere Ergebnisse lieferte als ein stärkerer. Dies deutet darauf hin, dass in der komplexen Umgebung einer lebenden Zelle zu viel Aktivität in einem Bereich manchmal das Gleichgewicht des gesamten Systems stören kann. Durch die sorgfältige Abstimmung der Genexpression schufen sie einen Hefestamm, der den Vorläufer wesentlich effektiver in die gewünschte Fettsäure umwandeln konnte als zuvor.

Das Team untersuchte auch einen anderen Aspekt: die Verhinderung der Hefe daran, das, was sie hergestellt hatte, wieder abzubauen. Sie entfernten ein Gen, das für einen zellulären Reinigungsprozess verantwortlich ist, der Fettsäuren natürlich abbaut, in der Hoffnung, dass dies die Anreicherung des wertvollen Produkts ermöglichen würde. Während diese Änderung zwar dazu führte, dass die Hefe insgesamt mehr Öl speicherte, hatte sie eine katastrophale Nebenwirkung: Die spezifische Fettsäure, die sie herzustellen versuchten, verschwand vollständig. Die Störung des Reinigungssystems schien den Stoffwechsel der Zelle so sehr zu verwirren, dass sie das Zielmolekül nicht mehr synthetisieren konnte. Dies schloss diese spezielle Strategie aus und verdeutlichte das empfindliche Gleichgewicht, das bei der Manipulation lebender Organismen erforderlich ist.

Durch diesen Prozess von Versuch, Irrtum und Verfeinerung gelang es den Forschern, einen Hefestamm zu entwickeln, der die höchste Menge dieser wertvollen Fettsäure produzierte, die jemals in einem Labor ohne den Einsatz komplexer industrieller Fermentationsanlagen dokumentiert wurde. In einfachen Schüttelkolbenkulturen erreichte die manipulierte Hefe eine Konzentration von 5,34 Milligramm pro Liter, wobei das Zielmolekül 0,47 Prozent des gesamten Fetts in den Zellen ausmachte. Diese Errungenschaft zeigt, dass Wissenschaftler durch das systematische Verständnis und die Anpassung der Stoffwechselwege eines Mikroorganismus diesen dazu bewegen können, komplexe, hochwertige Substanzen zu produzieren, die zuvor schwer zu erhalten waren. Die Arbeit legt den Grundstein für zukünftige Bemühungen, diese Produktion hochzufahren, was potenziell eine nachhaltige und zugängliche Quelle für ein Molekül mit bedeutendem Potenzial für Medizin und Ernährung bietet.