Enhanced production of cis-13,16-docosadienoic acid in Yarrowia lipolytica via systematic metabolic engineering

Diep in de microscopische wereld van eencellige schimmels heeft de natuur complexe fabrieken gebouwd die in staat zijn om complexe moleculen te assembleren uit eenvoudige ingrediënten zoals suiker. Onder deze moleculen behoren vetzuren, de bouwstenen van oliën en vetten die een vitale rol spelen in zowel de menselijke gezondheid als de natuurlijke wereld. Sommige van deze vetzuren, bekend als meervoudig onverzadigde vetten, zijn bijzonder waardevol omdat het menselijk lichaam ze niet zelf kan aanmaken; we moeten ze uit ons dieet halen. Eén zodanig molecuul, een keten van vierentwintig koolstofatomen genaamd cis-13,16-docosadieenzuur, heeft onlangs de aandacht van wetenschappers getrokken. Onderzoek suggereert dat dit specifieke vet krachtige eigenschappen bezit, waaronder het vermogen om de groei van bepaalde kankercellen te vertragen en ontstekingen te bestrijden. Tot nu toe was het verkrijgen van deze stof een moeilijke taak. Het komt van nature alleen voor in de zaden van een zeldzame winterplant, die traag groeit en moeilijk in grote hoeveelheden te kweken is. Chemische methoden om het in een laboratorium te creëren zijn even uitdagend, waarbij ingewikkelde stappen en hoge kosten komen kijken. Dit heeft onderzoekers doen zoeken naar een betere manier om het te produceren, waarbij zij hun blik richtten op de gist Yarrowia lipolytica, een robuust micro-organisme dat bekend staat om zijn vermogen om oliën te accumuleren.

De uitdaging ligt in het overtuigen van deze gist om een molecuul te maken dat het van nature niet produceert. De gist is al behoorlijk goed in het maken van een precursor genaamd linolzuur, maar het mist de specifieke instrumenten om die precursor uit te rekken tot de langere, complexere keten die vereist is voor het eindproduct. Om dit op te lossen, behandelde een team van onderzoekers van de Hunan Agricultural University en andere instellingen de gist als een biologische werkplaats, waarbij ze systematisch de genetische instrumenten toevoegden en aanpaste die nodig zijn om de klus te klaren. Ze begonnen door ervoor te zorgen dat de werkplaats over een overvloedige voorraad van het startmateriaal beschikte. Door genen van andere organismen te introduceren die fungeren als gespecialiseerde omzetters, slaagden ze erin de hoeveelheid linolzuur in de gistcellen te vergroten. Deze stap was cruciaal, aangezien een gebrek aan grondstoffen vaak de gehele productielijn blokkeert.

Met de voorraad aan grondstoffen veiliggesteld, richtte het team zich op de assemblageband zelf. Het omzetten van de precursor in het eindproduct vereist een tweestaps rekproces. De onderzoekers testten verschillende versies van de enzymen die verantwoordelijk zijn voor dit rekproces, vergelijkbaar met het proberen van verschillende gereedschappen om te zien welke het beste bij de klus past. Ze ontdekten dat één specifieke enzymcombinatie aanzienlijk beter werkte dan andere, waardoor de vetzuurketen succesvol werd verlengd. Het proces was echter nog niet efficiënt genoeg. De gist produceerde de tussenstap van de keten, maar had moeite om de klus te voltooien. Om dit op te lossen, probeerden de wetenschappers een techniek genaamd enzymfusie, waarbij ze twee van de noodzakelijke enzymen fysiek aan elkaar koppelden, in de hoop dat dit de overdracht van materialen tussen hen zou versoepelen. Verrassend genoeg werkte deze aanpak niet zoals verwacht. De gekoppelde enzymen leken elkaar in de weg te zitten, en de productie van het eindproduct verbeterde niet. Dit resultaat leerde het team dat het simpelweg aan elkaar plakken van instrumenten niet altijd zorgt dat ze beter werken; soms doet de ordening er meer toe dan de verbinding.

Onverzettelijk verschoof het team hun strategie om zich te concentreren op de kracht van de instructies die deze enzymen aansturen. Ze verhoogden het aantal kopieën van de genen die verantwoordelijk zijn voor het rekproces en testten verschillende genetische schakelaars, bekend als promotors, om te controleren hoe sterk deze genen werden aangezet. In een contra-intuïtieve bevinding ontdekten ze dat een zwakkere schakelaar eigenlijk betere resultaten opleverde dan een sterkere. Dit suggereert dat in de complexe omgeving van een levende cel te veel activiteit in één gebied soms de balans van het hele systeem kan verstoren. Door de expressie van de genen zorgvuldig af te stemmen, creëerden ze een stam van gist die de precursor veel effectiever kon omzetten in het gewenste vetzuur dan voorheen.

Het team verkende ook een andere invalshoek: het voorkomen dat de gist hetgeen het gemaakt heeft, afbreekt. Ze verwijderden een gen dat verantwoordelijk is voor een cellulair schoonmaakproces dat van nature vetzuren afbreekt, in de hoop dat dit de waardevolle stof zou laten accumuleren. Hoewel deze verandering ervoor zorgde dat de gist in totaal meer olie opsloeg, had het een rampzalig neveneffect: het specifieke vetzuur dat ze probeerden te maken, verdween volledig. De verstoring van het schoonmaaksysteem leek het metabolisme van de cel zo ernstig te verwarren dat de cel het doelmolecuul niet langer kon synthetiseren. Dit betekende dat die specifieke strategie niet deugde, wat benadrukte welk delicaat evenwicht vereist is bij het modificeren van levende organismen.

Door dit proces van vallen, opstaan en verfijning slaagden de onderzoekers erin een giststam te ontwikkelen die de hoogste hoeveelheid van dit waardevolle vetzuur produceerde die ooit in een laboratoriumomgeving is vastgesteld zonder gebruik te maken van complexe industriële fermentatieapparatuur. In eenvoudige shake-flask-culturen bereikte de gemodificeerde gist een concentratie van 5,34 milligram per liter, waarbij het doelmolecuul 0,47 procent van het totale vet in de cellen uitmaakte. Deze prestatie toont aan dat wetenschappers, door systematisch de metabole paden van een micro-organisme te begrijpen en aan te passen, een organisme kunnen stimuleren tot de productie van complexe, hoogwaardige stoffen die voorheen moeilijk te verkrijgen waren. Dit werk legt een fundament voor toekomstige inspanningen om deze productie op te schalen, wat potentieel een duurzame en toegankelijke bron kan bieden van een molecuul met aanzienlijke beloften voor de geneeskunde en voeding.