Enhanced production of cis-13,16-docosadienoic acid in Yarrowia lipolytica via systematic metabolic engineering
Questo studio ha potenziato sistematicamente la produzione di acido cis-13,16-docosadienoico (DDA) in *Yarrowia lipolytica* ottimizzando l'apporto di precursori e le vie di allungamento, portando a un ceppo (YL-11) che ha raggiunto un titolo record di DDA di 5,34 mg/L.
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Nel profondo del mondo microscopico dei funghi unicellulari, la natura ha costruito fabbriche intricate capaci di assemblare molecole complesse da ingredienti semplici come lo zucchero. Tra queste molecole ci sono gli acidi grassi, i mattoni di oli e grassi che svolgono ruoli vitali sia nella salute umana che nel mondo naturale. Alcuni di questi acidi grassi, noti come grassi polinsaturi, sono particolarmente preziosi perché il corpo umano non può produrli da solo; dobbiamo ottenerli dalla nostra dieta. Una di queste molecole, una catena a ventidue atomi di carbonio chiamata acido cis-13,16-docosadienoico, ha recentemente catturato l'attenzione degli scienziati. La ricerca suggerisce che questo grasso specifico possieda proprietà potenti, tra cui la capacità di rallentare la crescita di certe cellule cancerose e combattere l'infiammazione. Finora, ottenere questa sostanza è stato un compito difficile. Si trova naturalmente solo nei semi di una rara pianta invernale, che cresce lentamente ed è difficile da coltivare in grandi quantità. I metodi chimici per crearla in laboratorio sono altrettanto impegnativi, comportando passaggi complicati e costi elevati. Ciò ha spinto i ricercatori a cercare un modo migliore per produrla, rivolgendo i loro occhi verso il lievito Yarrowia lipolytica, un microrganismo robusto noto per la sua capacità di accumulare oli.
La sfida consiste nel convincere questo lievito a produrre una molecola che non produce naturalmente. Il lievito è già piuttosto bravo a produrre un precursore chiamato acido linoleico, ma manca degli strumenti specifici per allungare quel precursore nella catena più lunga e complessa richiesta per il prodotto finale. Per risolvere il problema, un team di ricercatori dell'Università Agricola di Hunan e di altre istituzioni ha trattato il lievito come un laboratorio biologico, aggiungendo e regolando sistematicamente gli strumenti genetici necessari per completare il lavoro. Hanno iniziato assicurandosi che il laboratorio avesse un'abbondante scorta di materia prima. Introducendo geni da altri organismi che agiscono come convertitori specializzati, sono riusciti ad aumentare la quantità di acido linoleico all'interno delle cellule di lievito. Questo passaggio era cruciale, poiché la mancanza di materia prima spesso crea un collo di bottiglia nell'intera linea di produzione.
Con la scorta di materia prima assicurata, il team ha spostato l'attenzione sulla linea di assemblaggio stessa. Convertire il precursore nel prodotto finale richiede un processo di allungamento in due fasi. I ricercatori hanno testato diverse versioni degli enzimi responsabili di questo allungamento, proprio come provare diversi strumenti per vedere quale si adatti meglio al lavoro. Hanno scoperto che una combinazione enzimatica specifica funzionava significativamente meglio di altre, estendendo con successo la catena dell'acido grasso. Tuttavia, il processo non era ancora abbastanza efficiente. Il lievito produceva lo stadio intermedio della catena, ma faticava a finire il lavoro. Per risolvere il problema, gli scienziati hanno provato una tecnica chiamata fusione enzimatica, in cui hanno collegato fisicamente due degli enzimi necessari, sperando che questo rendesse più fluido il trasferimento di materiali tra di essi. Sorprendentemente, questo approccio non ha funzionato come previsto. Gli enzimi collegati sembravano intralciarsi a vicenda e la produzione del prodotto finale non è migliorata. Questo risultato ha insegnato al team che semplicemente unire gli strumenti non significa sempre farli lavorare meglio; a volte, la disposizione conta più della connessione.
Non scoraggiati, i ricercatori hanno cambiato strategia concentrandosi sul potere delle istruzioni che guidano questi enzimi. Hanno aumentato il numero di copie dei geni responsabili del processo di allungamento e hanno testato diversi interruttori genetici, noti come promotori, per controllare quanto fortemente questi geni venissero attivati. In un ritrovamento controintuitivo, hanno scoperto che un interruttore più debole produceva risultati migliori rispetto a uno più forte. Ciò suggerisce che, nel complesso ambiente di una cella vivente, un eccesso di attività in un'area può talvolta interrompere l'equilibrio dell'intero sistema. Regolando attentamente l'espressione dei geni, hanno creato un ceppo di lievito che poteva convertire il precursore nell'acido grasso desiderato in modo molto più efficace rispetto a prima.
Il team ha esplorato anche un'altra angolazione: impedire al lievito di scomporre ciò che aveva prodotto. Hanno rimosso un gene responsabile di un processo di pulizia cellulare che degrada naturalmente gli acidi grassi, sperando che questo permettesse l'accumulo del prezioso prodotto. Sebbene questo cambiamento abbia causato l'accumulo di una maggiore quantità di olio complessivo, ha avuto un effetto collaterale disastroso: l'acido grasso specifico che stavano cercando di produrre è scomparso del tutto. La perturbazione del sistema di pulizia sembrava confondere il metabolismo cellulare così gravemente da non permettere più la sintesi della molecola bersaglio. Ciò ha escluso quella particolare strategia, evidenziando l'equilibrio delicato richiesto nell'ingegneria degli organismi viventi.
Attraverso questo processo di tentativi, errori e perfezionamento, i ricercatori sono riusciti a ingegnerizzare un ceppo di lievito che ha prodotto la più alta quantità di questo prezioso acido grasso mai registrata in un laboratorio senza utilizzare complessi apparecchiature di fermentazione industriale. In semplici colture in beuta, il lievito ingegnerizzato ha raggiunto una concentrazione di 5,34 milligrammi per litro, con la molecola bersaglio che costituiva lo 0,47 percento del grasso totale nelle cellule. Questo traguardo dimostra che, comprendendo e regolando sistematicamente le vie metaboliche di un microrganismo, gli scienziati possono indurre la produzione di sostanze complesse e di alto valore che prima erano difficili da ottenere. Il lavoro pone le basi per futuri sforzi di scalabilità della produzione, offrendo potenzialmente una fonte sostenibile e accessibile di una molecola con un significativo potenziale per la medicina e la nutrizione.
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