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Enhanced production of cis-13,16-docosadienoic acid in Yarrowia lipolytica via systematic metabolic engineering

이 연구는 전구체 공급과 신장 경로를 최적화함으로써 *Yarrowia lipolytica* 내 cis-13,16-docosadienoic acid (DDA) 생산을 체계적으로 향상시켰으며, 그 결과 5.34 mg/L라는 기록적인 DDA 역가를 달성한 균주(YL-11)를 확보하였다.

원저자: Ye Lin, Yi-Xiong Tang, Zhe-Ming Yuan, Meng-Yao Zhu, Xiao-Na Yang, Yun Tian, Xiao-Jun Ji, Xiao-Man Sun, Xiang-Yang Lu, Hu-Hu Liu

게시일 2026-09-24

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CC BY 4.0

원저자: Ye Lin, Yi-Xiong Tang, Zhe-Ming Yuan, Meng-Yao Zhu, Xiao-Na Yang, Yun Tian, Xiao-Jun Ji, Xiao-Man Sun, Xiang-Yang Lu, Hu-Hu Liu

원본 논문은 CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) 라이선스로 제공됩니다. ⚕️ 이것은 동료 심사를 거치지 않은 프리프린트의 AI 생성 설명입니다. 의학적 조언이 아닙니다. 이 내용을 바탕으로 건강 관련 결정을 내리지 마세요. 전체 면책 조항 읽기

단세포 균류의 미세한 세계 깊은 곳에서, 자연은 설탕과 같은 단순한 재료로부터 복잡한 분자를 조립할 수 있는 정교한 공장을 구축해 왔습니다. 이러한 분자 중에는 기름과 지방의 구성 성분인 지방산이 있는데, 이는 인간의 건강과 자연계 모두에서 중요한 역할을 합니다. 이 지방산 중 일부는 다가 불포화 지방산으로 알려져 있으며, 인체가 스스로 만들어낼 수 없기 때문에 반드시 식단을 통해 섭취해야 한다는 점에서 특히 가치가 높습니다. 최근 과학자들의 주목을 받은 분자 중 하나는 시스-13,16-도코사디엔산(cis-13,16-docosadienoic acid)이라 불리는 22개의 탄소 사슬입니다. 연구에 따르면 이 특정 지방은 특정 암세포의 성장을 늦추고 염증과 싸우는 강력한 특성을 지니고 있습니다. 지금까지 이 물질을 얻는 것은 어려운 과제였습니다. 이것은 성장이 느리고 대량 재배가 어려운 희귀한 겨울 식물의 씨앗에서만 자연적으로 발생합니다. 실험실에서 이를 만들기 위한 화학적 방법 또한 복잡한 단계와 높은 비용을 수반하여 매우 까다롭습니다. 이로 인해 연구자들은 더 나은 생산 방법을 찾게 되었고, 기름을 축적하는 능력이 뛰어난 것으로 알려진 강건한 미생물인 효모 Yarrowia lipolytica에 눈을 돌렸습니다.

문제는 이 효모가 자연적으로는 생성하지 않는 분자를 만들도록 설득하는 데 있었습니다. 이 효모는 이미 리놀레산이라는 전구체를 만드는 데는 꽤 능숙하지만, 최종 제품에 필요한 더 길고 복잡한 사슬로 그 전구체를 늘려줄 구체적인 도구가 부족합니다. 이를 해결하기 위해 후난 농업대학교와 다른 기관의 연구팀은 효모를 하나의 생물학적 작업장처럼 취급하여, 작업을 완수하는 데 필요한 유전적 도구들을 체계적으로 추가하고 조정했습니다. 그들은 먼저 작업장에 충분한 원료가 공급되도록 하는 것부터 시작했습니다. 특수한 변환기 역할을 하는 다른 생물체의 유전자를 도입함으로써, 그들은 효모 세포 내의 리놀레산 양을 성공적으로 증가시켰습니다. 이 단계는 원료의 부족이 전체 생산 라인의 병목 현상을 일으키는 경우가 많기 때문에 매우 중요했습니다.

원료 공급이 확보되자, 연구팀은 조립 라인 자체에 주목했습니다. 전구체를 최종 제품으로 변환하려면 두 단계의 연장 과정이 필요합니다. 연구자들은 이 연장 과정을 담당하는 다양한 버전의 효소를 테스트했는데, 이는 마치 어떤 도구가 작업에 가장 잘 맞는지 확인하기 위해 여러 도구를 시험해보는 것과 같았습니다. 그들은 한 특정 효소 조합이 다른 조합보다 훨씬 더 효과적으로 작동하여 지방산 사슬을 성공적으로 연장한다는 것을 발견했습니다. 그러나 과정은 아직 충분히 효율적이지 않았습니다. 효모는 사슬의 중간 단계는 만들어냈지만, 작업을 마무리하는 데 어려움을 겪었습니다. 이를 해결하기 위해 과학자들은 효소 융합(enzyme fusion)이라는 기술을 시도했는데, 이는 두 개의 필요한 효소를 물리적으로 결합하여 재료의 이동이 더 매끄럽게 이루어지기를 기대하는 방식이었습니다. 놀랍게도 이 접근 방식은 예상대로 작동하지 않았습니다. 결합된 효소들이 서로 방해가 되는 것처럼 보였고, 최종 제품의 생산도 개선되지 않았습니다. 이 결과는 단순히 도구를 붙여 놓는다고 해서 항상 더 잘 작동하는 것은 아니며, 때로는 연결보다 배치가 더 중요하다는 점을 연구팀에게 가르쳐 주었습니다.

굴하지 않고 연구자들은 이 효소들을 구동하는 지침의 힘에 집중하며 전략을 전환했습니다. 그들은 연장 과정에 책임이 있는 유전자의 복제 수를 늘렸고, 이 유전자들이 얼마나 강하게 켜지는지를 제어하기 위해 프로모터라고 불리는 다양한 유전적 스위치를 테스트했습니다. 역설적이게도, 그들은 더 약한 스위치가 더 강한 스위치보다 더 나은 결과를 낸다는 것을 발견했습니다. 이는 살아있는 세포라는 복잡한 환경 속에서 한 영역에서의 과도한 활동이 때때로 전체 시스템의 균형을 깨뜨릴 수 있음을 시사합니다. 유전자 발현을 세밀하게 조정함으로써, 그들은 전구체를 원하는 지방산으로 훨씬 더 효과적으로 변환할 수 있는 효모 균주를 만들어냈습니다.

연구팀은 또 다른 각도에서도 탐구했습니다. 바로 효모가 만든 것을 분해하는 것을 막는 것이었습니다. 그들은 효모가 자연적으로 지방산을 분해하는 세포 정화 과정에 관여하는 유전자를 제거하여, 귀중한 제품이 더 많이 축적되기를 기대했습니다. 이 변화는 효모가 전체적으로 더 많은 기름을 저장하게 만들었지만, 치명적인 부작용을 초래했습니다. 목표로 했던 특정 지방산이 완전히 사라진 것입니다. 정화 시스템의 교란이 세포의 대사를 너무 심하게 혼란스럽게 하여, 세포가 더 이상 표적 분자를 합성할 수 없게 만든 것으로 보였습니다. 이로써 해당 전략은 배제되었으며, 이는 살아있는 유기체를 공학적으로 설계할 때 요구되는 섬세한 균형을 강조해 주었습니다.

이러한 시행착오와 정제의 과정을 통해, 연구진은 복잡한 산업 발효 장비를 사용하지 않고도 실험실 환경에서 기록된 가장 높은 수준의 이 귀중한 지방산을 생산하는 효모 균주를 성공적으로 설계했습니다. 단순한 흔들림 배양(shake-flask culture)에서, 엔지니어링된 효모는 리터당 5.34 밀리그램의 농도에 도달했으며, 표적 분자는 세포 전체 지방의 0.47 퍼센트를 차지했습니다. 이 성과는 미생물의 대사 경로를 체계적으로 이해하고 조정함으로써, 과학자들이 이전에 얻기 어려웠던 복잡하고 고부가가치의 물질을 생산하도록 유도할 수 있음을 보여줍니다. 이 연구는 향-생산 규모를 확대하기 위한 미래의 노력을 위한 토대를 마련하며, 잠재적으로 의학과 영양 분야에서 큰 가능성을 지닌 분자의 지속 가능하고 접근 가능한 공급원을 제공할 수 있습니다.

기술 요약: 체계적 대사 공학을 통한 Yarrowia lipolytica 내 cis-13,16-docosadienoic acid 생산 향상

문제 정의
cis-13,16-docosadienoic acid (DDA)는 암 치료, 항염증 적용 및 항균 치료에 입증된 잠재력을 가진 22탄소 오메가-6 다가 불포화 지방산(PUFA)이다. 현재 DDA 생산은 상당한 제약에 직면해 있다: Eranthis hyemalis로부터의 천연 추출은 긴 식재 주기와 엄격한 환경 요구 조건으로 인해 어려움을 겪고 있으며, 화학적 합성은 복잡한 반응 단계, 낮은 수율 및 높은 비용이라는 문제를 안고 있다. 비록 이전 연구들이 유용 효모인 Yarrowia lipolytica Po1f에서 DDA를 합성하는 타당성을 확립했으나, 생산 수준이 낮게 유지되어 생합성 병목 현상을 극복하기 위한 추가적인 대사 공학이 필요했다.

방법론
본 연구는 Y. lipolytica Po1f에서 DDA 생합성을 향상시키기 위해 체계적인 대사 공학 접근 방법을 채택하였다. 전략은 네 가지 순차적 단계로 구성되었다:

전구체 공급 강화: DDA의 핵심 전구체인 리놀레산(LA)의 공급을 늘리기 위해, 연구진은 이종 $\Delta$ 12-desaturases를 스크리닝하고 과발현시켰다. 올레산(OA)을 LA로 전환하기 위해, 내생적 Yl $\Delta$ 12D 또는 이종 Fm $\Delta$ 12D (from Fusarium verticillioides)를 발현하도록 균주를 구축하였다.
경로 최적화 (효소 비교): 두 단계 연장 경로(LA $\rightarrow$ EDA $\rightarrow$ DDA)를 최서화하기 위해 두 종류의 $\Delta$ 9-elongases인 Ig $\Delta$ 9E (from Isochrysis galbana)와 Eg $\Delta$ 9E (from Euglena gracilis)를 비교하였다. 이들은 엔지니어링된 균주 내에서 EhELO1 (from E. hyemalis) ELO-elongase와 함께 결합되었다.
효소 융합 및 공동 과발현: 반응 효율을 높이기 위해, 연구진은 G4S 및 2A 링커를 사용하여 Ig $\Delta$ 9E와 EhELO1의 융합 발현을 시도하였다. 이후, 두 연장 유전자(Ig $\Delta$ 9E 및 EhELO1)의 공동 과발현을 통해 경로 플럭스를 향상시키는 데 집중하였으며, EhELO1 발현을 구동하는 다양한 프로모터를 평가하여 두 번째 연장 단계가 속도 제한 단계임을 확인하였다.
분해 경로 차단: 지질 축적과 DDA 보유를 높이기 위해, 최적의 성능을 보인 균주에서 퍼옥시좀 생성 인자 유전자인 PEX10을 파괴하여 $\beta$ -산화 경로를 통한 지방산 분해를 차단하였다.

주요 결과

전구체 공급: 이종 Fm $\Delta$ 12D (균주 YL-2)의 과발현이 내생적 Yl $\Delta$ 12D보다 우수한 것으로 나타났으며, OA 함량을 줄이는 동시에 LA 함량을 총 지방산(TFAs)의 18.64%(야생형)에서 46.12%로 증가시켰다.
연장 효율: 두 종류의 $\Delta$ 9-elongases를 비교했을 때, Ig $\Delta$ 9E (균주 YL-3)가 Eg $\Delta$ 9E (균주 YL-4)보다 유의미하게 높은 효율을 보였다. YL-3는 0.12%의 DDA를 생산한 반면, YL-4는 0.03%만을 생산하였다.
효소 융합: Ig $\Delta$ 9E와 EhELO1의 융합 발현(균주 YL-5 및 YL-6)은 DDA 생산을 개선하는 데 실패하였다. 첫 번째 연장 단계(LA에서 EDA로)는 기능적으로 유지되었으나, 두 번째 단계(EDA에서 DDA로)는 입체 장애 또는 EhELO1의 활성 부위에 영향을 미치는 미스폴딩(misfolding)으로 인해 저해된 것으로 보인다.
프로모터 최적화: 연장 유전자의 공동 과발현과 프로모터 스크리닝을 결합한 방식이 가장 큰 개선을 가져왔다. EhELO1을 구동하기 위해 GMPp 프로모터를 사용한 균주 YL-11은 **총 지방산(TFAs)의 0.47%**라는 가장 높은 DLA 함량을 달却하였다. 특히, 약한 GMPp 프로모터가 더 강한 프로모터들보다 우수한 성능을 보여, 베이스라인 균주인 YL-7 대비 DDA 함량이 241.84% 증가하였다.
PEX10 파괴: PEX10 파괴(균주 YL-12)를 지방산 분해를 차단하기 위한 전략으로 테스트하였으나, 이 접근법은 DDA 생산을 개선하지 못했다. 대신, 해당 결실은 심각한 퍼옥시좀 기능 장애, 바이오매스의 급격한 감소(12.51 g/L에서 6.91 g/L로), 그리고 검출 가능한 DDA의 완전한 소실을 초래하였다.

최종 결과
최적화된 엔지니어링 균주인 YL-11은 배양 최적화 없이 흔들기 배양(shake-flask culture)에서 5.34 mg/L의 DDA 역가를 달성하였다. 이는 엔지니어링된 미생물 중 이 규모에서 보고된 가장 높은 DDA 역가이다.

의의 및 주장
저자들은 본 연구가 Y. lipolytica를 DDA 생산을 위한 지속 가능한 미생물 플랫폼으로서의 잠재력을 입증한다고 주장한다. 본 연구의 핵심은 다음과 같다:

체계적인 대사 공학, 특히 전구체 공급 강화와 경로 플럭스 최적화의 결합은 고부가가치 PUFA 생산에 효과적이다.
적절한 프로모터 강도의 선택은 매우 중요하며 맥락 의존적이다. 특정 경로 단계에서는 더 강한 프로모터가 반드시 더 나은 결과를 보장하지 않는다.
현재의 역가는 이 규모에서 가장 높지만, 저자들은 추가적인 최적화가 필요함을 인정한다. 구체적으로, 저자들은 향후 DDA 보유를 높이기 위해 $\beta$ -산화 유전자인 POX(PEX10 대신)를 파괴하는 것이 지방산 분해를 차단할 것이라고 제안한다. 또한, 트리글리세리드 내 DDA의 결합을 개선하기 위한 리소포스파티딕 산 아실트랜스퍼레이즈(lysophosphatidic acid acyltransferases)의 도입과, 유가식(fed-batch) 전략을 위한 탄소원, C/N 비율, pH, 용존 산소 등의 배양 파라미터 최적화를 권장한다.

본 논문은 상당한 진전이 이루어졌음에도 불구하고, 엔지니어링된 균주 YL-11이 산업적 DDA 생산을 위한 효율적인 미생물 발효를 향한 기초적인 단계 역할을 한다고 결론짓는다.

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