Exploring genetic variation in insecticide resistance loci in Anopheles gambiae s.l. populations from Ghana

Problemstellung
Malaria stellt weiterhin eine kritische gesundheitspolitische Belastung in Subsahara-Afrika dar, wobei Ghana einen signifikanten Anteil an den weltweiten Fallzahlen hat. Die Vektorkontrolle stützt sich stark auf insektizidbehandelte Netze (ITNs) und Innenraumgespritzungen (IRS), deren Wirksamkeit jedoch zunehmend durch die weit verbreitete Insektizidresistenz in Anopheles gambiae sensu lato (s.l.) Populationen beeinträchtigt wird. Während Resistenzmechanismen wie Zielstellenmutationen (in vgsc, rdl, ace1) und metabolische Resistenzen (in gste2) bekannt sind, bestehen in Ghana erhebliche geografische Lücken hinsichtlich der Phylogenie, der genetischen Diversität und der spezifischen Verteilung von Resistenzallelen über verschiedene ökologische Zonen hinweg. Zudem ist die morphologische Identifizierung von An. gambiae s.l. Arten oft unzureichend, was molekulare Werkzeuge für eine präzise Überwachung erforderlich macht.

Methodik
Die Studie verwendete einen kostengünstigen, hochdurchsatzfähigen Multiplex-Amplikon-Sequenzierungsansatz mittels Oxford Nanopore Technologies (ONT).

• Probenahme: Es wurden 330 An. gambiae s.l. Mücken aus 18 Standorten in den drei großen ökologischen Zonen Ghanas gesammelt: Küsten-Savanne, Waldzone und Guinea-Savanne. Eine Teilmenge dieser Mücken war zuvor mittels WHO-Röhrentests auf ihre Anfälligkeit gegenüber Pyrethroiden und Organophosphaten phänotypisiert worden.
• Sequenzierungsstrategie: Die DNA wurde aus einzelnen Mücken extrahiert. Multiplex-PCR-Assays wurden entwickelt, um sieben Genomregionen zu amplifizieren: vier Domänen des spannungsgesteuerten Natriumkanals (vgsc), Teilsequenzen von ace1, rdl und gste2 sowie Marker zur Speziesidentifizierung (ITS1, ITS2, SINE200, cox1, nd4, 28S, IGS).
• Barcoding und Sequenzierung: Einzigartige 8bp-Barcodes wurden an die Primer angehängt, um das Pooling der Proben zu ermöglichen. Die Bibliotheken wurden mit dem Native Barcoding Kit 24 V14 vorbereitet und auf einem MinION Mk1B-Gerät mit r10.4.1 Flow Cells sequenziert.
• Bioinformatik: Die Reads wurden basecalled, demultiplexiert und an das An. gambiae Referenzgenom (AgamP4) ausgerichtet. Varianten wurden mittels FreeBayes und GATK HaplotypeCaller aufgerufen, auf Qualität gefiltert und annotiert. Die Speziesbestimmung erfolgte basierend auf der Anwesenheit/Abwesenheit der SINE200-Insertion. Phylogenetische und Diversitätsanalysen wurden anhand von ITS2- und mitochondrialen Sequenzen durchgeführt.

Wesentliche Beiträge und Ergebnisse

• Speziesverteilung: Die molekulare Identifizierung ergab An. coluzzii als die vorherrschende Spezies in der Küstenzone (77,6 %) und der Waldzone (86,5 %), während An. gambiae s.s. in der Guinea-Savanne am häufigsten vorkam (50,0 %). Hybride wurden in allen Zonen nachgewiesen.
• Genetische Diversität und Genfluss: Die phylogenetische Analyse von ITS2 und mitochondrialen Sequenzen zeigte eine geringe Nukleotiddiversität und keine deutliche Clusterbildung nach Geografie oder Spezies, was auf einen hohen Genfluss innerhalb der An. gambiae s.l. Populationen in Ghana hindeutet.
• Detektion von Resistenzallelen: Die Studie identifizierte 20 SNPs über die Zielloci hinweg, einschließlich 31 nicht-synonymen Mutationen.
  • Bekannte Mutationen: 13 zuvor assoziierte Resistenzmutationen wurden nachgewiesen: 7 in vgsc (einschließlich der hochfrequenten L995F bei 75 % und L995S bei 6 %), 2 in rdl (A296G bei 51 %), 1 in ace1 (G280S bei 22 %) und 3 in gste2 (I114T, F120L, L119V).
  • Neue und aufkommende Varianten: 17 neuartige SNPs wurden identifiziert. Bemerkenswert ist die gste2-Mutation T154S, die mit einer Frequenz von 24 % nachgewiesen wurde – eine Variante, die kürzlich in Guinea-Bissau beobachtet wurde. Andere neuartige Varianten umfassten vgsc A1553T und L1680F.
  • Kopplungsungleichgewicht (Linkage Disequilibrium): Es wurde ein starkes Kopplungsungleichgewicht zwischen den vgsc-Mutationen V402L und I1527T (r² = 0,90) beobachtet, was darauf hindeutet, dass sie häufig auf demselben Haplotyp vorkommen.
• Spezies-spezifische Variationen: Signifikante Unterschiede in den Allelfrequenzen wurden zwischen den Spezies festgestellt. Beispielsweise war vgsc L995F in An. gambiae s.s. (90 %) höher als in An. coluzzii (72 %), während vgsc V402L und I1527T in An. coluzzii signifikant höher waren.
• Phänotyp-Genotyp-Assoziation: Obwohl die meisten SNPs in der begrenzten phänotypisierten Teilmenge keine signifikante Assoziation mit den Resistenzphänotypen zeigten, waren die heterozygoten Genotypen von vgsc L995S und I1527T signifikant mit Deltamethrin bzw. Permethrin-Resistenz assoziiert.

Bedeutung
Die Arbeit zeigt, dass die hochdurchsatzfähige Multiplex-Amplikon-Sequenzierung mittels Nanopore-Technologie eine skalierbare, kosteneffiziente Methode für das genomische Monitoring von Malariavektoren darstellt. Sie charakterisiert erfolgreich die genetische Landschaft der Insektizidresistenz in Ghana, offenbart ein komplexes Gemisch aus bekannten und neuartigen Varianten und unterstreicht die dynamische Natur der Resistenzentwicklung. Die Ergebnisse verdeutlichen die Notwendigkeit eines kontinuierlichen genomischen Monitorings, um gezieltes Management der Insektizidresistenz und adaptive Vektorkontrollstrategien zu unterstützen, insbesondere angesichts der Belege für einen hohen Genfluss, der die schnelle Ausbreitung von Resistenzallelen über ökologische Zonen hinweg begünstigen kann.