Exploring genetic variation in insecticide resistance loci in Anopheles gambiae s.l. populations from Ghana

Problematica
La malaria rimane un carico critico per la salute pubblica nell'Africa sub sahariana, con il Ghana che contribuisce significativamente al numero globale di casi. Il controllo dei vettori si basa pesantemente su reti trattate con insetticida (ITN) e sulla irrorazione residua degli ambienti interni (IRS), ma la loro efficacia è sempre più compromessa dalla diffusa resistenza agli insetticidi nelle popolazioni di Anopheles gambiae sensu lato (s.l.). Sebbene siano noti i meccanismi di resistenza come le mutazioni del sito bersaglio (in vgsc, rdl, ace1) e la resistenza metabolica (in gste2), esistono lacune geografiche significative in Ghana riguardanti la filogenesi, la diversità genetica e la distribuzione specifica degli alleli di resistenza attraverso le diverse zone ecologiche. Inoltre, l'identificazione morfologica delle specie di An. gambiae s.l. è spesso inadeguata, rendendo necessari strumenti molecolari per una sorveglianza precisa.

Metodologia
Lo studio ha impiegato un approccio di sequenziamento di ampliconi multiplex ad alto rendimento e a basso costo utilizzando la tecnologia Oxford Nanopore Technologies (ONT).

• Campionamento: Sono stati raccolti 330 zanzare An. gambiae s.l. da 18 siti attraverso le tre principali zone ecologiche del Ghana: Savana Costiera, Foresta e Savana della Guinea. Un sottoinsieme di queste zanzare era stato precedentemente fenotipizzato per la suscettibilità a piretroide e organofosfati tramite test in tubetto WHO.
• Strategia di sequenziamento: Il DNA è stato estratto dai singoli esemplari di zanzara. Sono stati progettati saggi di PCR multiplex per amplificare sette regioni genomiche: quattro domini del canale del sodio voltaggio-dipendente (vgsc), sequenze parziali di ace1, rdl e gste2, oltre a marcatori di identificazione della specie (ITS1, ITS2, SINE200, cox1, nd4, 28S, IGS).
• Barcoding e Sequenziamento: Barcode unici di 8 bp sono stati attaccati ai primer per consentire l'accorpamento dei campioni. Le librerie sono state preparate utilizzando il Native Barcoding Kit 24 V14 e sequenziate su un dispositivo MinION Mk1B con flow cell r10.4.1.
• Bioinformatica: Le letture sono state sottoposte a basecalling, demultiplexing e allineamento al genoma di riferimento di An. gambiae (AgamP4). Le varianti sono state identificate tramite FreeBayes e GATK HaplotypeCaller, filtrate per qualità e annotate. Le specie sono state assegnate in base alla presenza/assenza dell'inserzione SINE200. Le analisi filogenetiche e di diversità sono state condotte su sequenze ITS2 e mitocondriali.

Contributi Chiave e Risultati

• Distribuzione delle Specie: L'identificazione molecolare ha rivelato An. coluzzii come la specie predominante nelle zone Costiera (77,6%) e Forestale (86,5%), mentre An. gambiae s.s. è stata più prevalente nella zona della Savana della Guinea (50,0%). Sono stati rilevati ibridi in tutte le zone.
• Diversità Genetica e Flusso Genico: L'analisi filogenetica di ITS2 e delle sequenze mitocondriali ha mostrato una bassa diversità nucleotidica e l'assenza di raggruppamenti distinti per geografia o specie, indicando un alto flusso genico tra le popolazioni di An. gambiae s.l. in Ghana.
• Rilevamento degli Alleli di Resistenza: Lo studio ha identificato 20 SNP attraverso i loci target, incluse 31 mutazioni non sinonime.
  • Mutazioni Note: Sono state rilevate 13 mutazioni di resistenza precedentemente associate: 7 in vgsc (inclusa l'alta frequenza di L995F al 75% e L995S al 6%), 2 in rdl (A296G al 51%), 1 in ace1 (G280S al 22%) e 3 in gste2 (I114T, F120L, L119V).
  • Varianti Nuove ed Emergenti: Sono stati identificati 17 SNP novel. In particolare, la mutazione gste2 T154S è stata rilevata con una frequenza del 24%, una variante recentemente osservata in Guinea-Bissau. Altre varianti novel includono vgsc A1553T e L1680F.
  • Disequilibrio di Associazione: È stato osservato un forte linkage tra le mutazioni vgsc V402L e I1527T (r² = 0,90), suggerendo che esse si presentino frequentemente sullo stesso aplotipo.
• Variazioni Specifiche per Specie: Sono state osservate differenze significative nelle frequenze alleliche tra le specie. Ad esempio, la mutazione vgsc L995F era più alta in An. gambiae s.s. (90%) rispetto a An. coluzzii (72%), mentre vgsc V402L e I1527T erano significativamente più alte in An. coluzzii.
• Associazione Fenotipo-Genotipo: Sebbene la maggior parte degli SNP non abbia mostrato un'associazione significativa con i fenotipi di resistenza nel limitato sottoinsieme fenotipizzato, i genotipi eterozigoti di vgsc L995S e I1527T sono stati significativamente associati alla resistenza a deltametrina e permetrina, rispettivamente.

Significato
L'articolo dimostra che il sequenziamento di ampliconi multiplex ad alto rendimento utilizzando la tecnologia nanopore è un metodo scalabile e conveniente per la sorveglianza genomica dei vettori della malaria. Ha caratterizzato con successo il panorama genetico della resistenza agli insetticidi in Ghana, rivelando un complesso mix di varianti note e nuove e sottolineando la natura dinamica dell'evoluzione della resistenza. I risultati evidenziano la necessità di un monitoraggio genomico continuo per informare la gestione mirata della resistenza agli insetticidi e le strategie di controllo vettoriale adattive, particolarmente dato l'evidenza di un alto flusso genico che può facilitare la rapida diffusione degli alleli di resistenza attraverso le zone ecologiche.