Exploring genetic variation in insecticide resistance loci in Anopheles gambiae s.l. populations from Ghana

Planteamiento del Problema
La malaria sigue siendo una carga crítica para la salud pública en el África subsahariana, y Ghana contribuye significativamente al número global de casos. El control de vectores depende en gran medida de los mosquiteros tratados con insecticidas (ITN) y la roción residual intradomiciliaria (IRS), pero su eficacia se ve cada vez más comprometida por la resistencia generalizada a los insecticidas en las poblaciones de Anopheles gambiae sensu lato (s.l.). Aunque se conocen mecanismos de resistencia como las mutaciones en el sitio diana (en vgsc, rdl, ace1) y la resistencia metabólica (en gste2), existen vacíos geográficos significativos en Ghana con respecto a la filogenia, la diversidad genética y la distribución específica de los alelos de resistencia a través de las diferentes zonas ecológicas. Además, la identificación morfológica de las especies de An. gambiae s.l. suele ser inadecuada, lo que requiere herramientas moleculares para una vigilancia precisa.

Metodología
El estudio empleó un enfoque de secuenciación de amplicones multiplex de bajo costo y alto rendimiento utilizando Oxford Nanopore Technologies (ONT).

• Muestreo: Se recolectaron 330 mosquitos An. gambiae s.l. en 18 sitios a través de las tres principales zonas ecológicas de Ghana: Sabana Costera, Bosque y Sabana de Guinea. Un subconjunto de estos mosquitos había sido fenotipado previamente para la susceptibilidad a piretroides y organofosforados mediante pruebas de tubo de la OMS.
• Estrategia de Secuenciación: Se extrajo el ADN de mosquitos individuales. Se diseñaron ensayos de PCR multiplex para amplificar siete regiones genómicas: cuatro dominios del canal de sodio dependiente de voltaje (vgsc), secuencias parciales de ace1, rdl y gste2, además de marcadores de identificación de especies (ITS1, ITS2, SINE200, cox1, nd4, 28S, IGS).
• Codificación y Secuenciación: Se adjuntaron códigos de barras (barcodes) únicos de 8 pb a los cebadores para permitir la agrupación de muestras. Las librerías se prepararon con el Native Barcoding Kit 24 V14 y se secuenciaron en un dispositivo MinION Mk1B con celdas de flujo r10.4.1.
• Bioinformática: Las lecturas fueron sometidas a basecalling, demultiplexación y alineación con el genoma de referencia de An. gambiae (AgamP4). Las variantes fueron identificadas mediante Freeなes y GATK HaplotypeCaller, filtradas por calidad y anotadas. Las especies se asignaron basándose en la presencia/ausencia de la inserción SINE200. Los análisis filogenéticos y de diversidad se realizaron en las secuencias de ITS2 y mitocondriales.

Contribuciones Clave y Resultados

• Distribución de Especies: La identificación molecular reveló a An. coluzzii como la especie predominante en las zonas Costera (77.6%) y de Bosque (86.5%), mientras que An. gambiae s.s. fue la más prevalente en la zona de la Sabana de Guinea (50.0%). Se detectaron híbridos en todas las zonas.
• Diversidad Genética y Flujo Génico: El análisis filogenético de las secuencias de ITS2 y mitocondriales mostró una baja diversidad de nucleótidos y la ausencia de agrupamientos distintos por geografía o especie, lo que indica un alto flujo génico entre las poblaciones de An. gambiae s.l. en Ghana.
• Detección de Alelos de Resistencia: El estudio identificó 20 SNPs en los loci objetivo, incluyendo 31 mutaciones no sinónimas.
  • Mutaciones Conocidas: Se detectaron 13 mutaciones de resistencia previamente asociadas: 7 en vgsc (incluyendo las de alta frecuencia L995F al 75% y L995S al 6%), 2 en rdl (A296G al 51%), 1 en ace1 (G280S al 22%) y 3 en gste2 (I114T, F120L, L119V).
  • Variantes Nuevas y Emergentes: Se identificaron 17 SNPs novedosos. Notablemente, la mutación gste2 T154S se detectó con una frecuencia del 24%, una variante observada recientemente en Guinea-Bisáu. Otras variantes novedosas incluyeron vgsc A1553T y L1680F.
  • Desequilibrio de Ligamiento: Se observó un fuerte ligamiento entre las mutaciones de vgsc V402L e I1527T (r² = 0.90), lo que sugiere que ocurren frecuentemente en el mismo haplotipo.
• Variaciones Específicas de la Especie: Se observaron diferencias significativas en las frecuencias alélicas entre especies. Por ejemplo, vgsc L995F fue mayor en An. gambiae s.s. (90%) que en An. coluzzii (72%), mientras que vgsc V402L e I1527T fueron significativamente mayores en An. coluzzii.
• Asociación Fenotipo-Genotipo: Aunque la mayoría de los SNPs no mostraron una asociación significativa con los fenotipos de resistencia en el subconjunto limitado fenotipado, los genotipos heterocigotos de vgsc L995S e I1527T se asociaron significativamente con la resistencia a la deltametrina y la permetrina, respectivamente.

Significancia
El artículo demuestra que la secuenciación de amplicones multiplex de alto rendimiento mediante tecnología de nanoporos es un método escalable y rentable para la vigilancia genómica de los vectores de la malaria. Caracteriza con éxito el panorama genético de la resistencia a los insecticidas en Ghana, revelando una mezcla compleja de variantes conocidas y novedosas, y destacando la naturaleza dinámica de la evolución de la resistencia. Los hallazgos subrayan la necesidad de un monitoreo genómico continuo para informar la gestión dirigida de la resistencia a los insecticidas y las estrategias de control de vectores adaptativas, particularmente ante la evidencia de un alto flujo génico que podría facilitar la rápida propagación de los alelos de resistencia a través de las zonas ecológicas.