Exploring genetic variation in insecticide resistance loci in Anopheles gambiae s.l. populations from Ghana

Problema
A malária continua a ser uma carga crítica de saúde pública na África Subsaariana, com o Gana contribuindo significativamente para o número global de casos. O controle vetorial depende fortemente de redes tratadas com inseticidas (ITNs) e pulverização intradomiciliar (IRS), mas a sua eficácia é cada vez mais comprometida pela disseminação da resistência a inseticidas nas populações de Anopheles gambiae sensu lato (s.l.). Embora mecanismos de resistência como mutações no sítio-alvo (em vgsc, rdl, ace1) e resistência metabólica (em gste2) sejam conhecidos, existem lacunas geográficas significativas em relação à filogenia, diversidade genética e distribuição específica de alelos de resistência nas diferentes zonas ecológicas do Gana. Além disso, a identificação morfológica das espécies de An. gambiae s.l. é frequentemente inadequada, necessitando de ferramentas moleculares para uma vigilância precisa.

Metodologia
O estudo empregou uma abordagem de sequenciamento de amplicons multiplex de alto rendimento e baixo custo utilizando a tecnologia Oxford Nanopore (ONT).

• Amostragem: 330 mosquitos An. gambiae s.l. foram recolhidos em 18 locais através das três principais zonas ecológicas do Gana: Savana Costeira, Floresta e Savana da Guiné. Um subconjunto destes mosquitos tinha sido previamente fenotipado para suscetibilidade a piretroides e organofosforados utilizando testes de tubo da OMS.
• Estratégia de Sequenciamento: O DNA foi extraído de mosquitos individuais. Ensaios de PCR multiplex foram desenhados para amplificar sete regiões genómicas: quatro domínios do canal de sódio dependente de voltagem (vgsc), sequências parciais de ace1, rdl e gste2, juntamente com marcadores de identificação de espécies (ITS1, ITS2, SINE200, cox1, nd4, 28S, IGS).
• Barcoding e Sequenciamento: Barcodes únicos de 8pb foram anexados aos primers para permitir a união de amostras (pooling). As bibliotecas foram preparadas utilizando o Native Barcoding Kit 24 V14 e sequenciadas num dispositivo MinION Mk1B com flow cells r10.4.1.
• Bioinformática: As leituras (reads) foram submetidas a basecalling, demultiplexagem e alinhamento com o genoma de referência de An. gambiae (AgamP4). As variantes foram chamadas usando FreeBayes e GATK HaplotypeCaller, filtradas por qualidade e anotadas. As espécies foram atribuídas com base na presença/ausência da inserção SINE200. As análises filogenéticas e de diversidade foram conduzidas em sequências de ITS2 e mitocondriais.

Principais Contribuições e Resultados

• Distribuição de Espécies: A identificação molecular revelou a An. coluzzii como a espécie predominante nas zonas Costeira (77,6%) e de Floresta (86,5%), enquanto a An. gambiae s.s. foi mais prevalente na zona da Savana da Guiné (50,0%). Híbridos foram detetados em todas as zonas.
• Diversidade Genética e Fluxo Génico: A análise filogenética de sequências de ITS2 e mitocondriais mostrou baixa diversidade de nucleótidos e ausência de agrupamentos distintos por geografia ou espécie, indicando um alto fluxo génico entre as populações de An. gambiae s.l. no Gana.
• Deteção de Alelos de Resistência: O estudo identificou 20 SNPs nos loci alvo, incluindo 31 mutações não sinónimas.
  • Mutações Conhecidas: Foram detetadas 13 mutações de resistência previamente associadas: 7 em vgsc (incluindo a alta frequência L995F a 75% e L995S a 6%), 2 em rdl (A296G a 51%), 1 em ace1 (G280S a 22%) e 3 em gste2 (I114T, F120L, L119V).
  • Variantes Novas e Emergentes: Foram identificados 17 SNPs novos. Notavelmente, a mutação gste2 T154S foi detetada com uma frequência de 24%, uma variante observada recentemente na Guiné-Bissau. Outras variantes novas incluíram vgsc A1553T e L1680F.
• Desequilíbrio de Ligação: Foi observada uma forte ligação entre as mutações de vgsc V402L e I1527T (r² = 0,90), sugerindo que ocorrem frequentemente no mesmo haplótipo.
• Variações Específicas de Espécie: Diferenças significativas nas frequências alélicas foram observadas entre espécies. Por exemplo, a mutação vgsc L995F foi maior em An. gambiae s.s. (90%) do que em An. coluzzii (72%), enquanto as mutações vgsc V402L e I1527T foram significativamente mais altas em An. coluzzii.
• Associação Fenótipo-Genótipo: Embora a maioria dos SNPs não tenha mostrado associação significativa com os fenótipos de resistência no subconjunto limitado fenotipado, os genótipos heterozigotos de vgsc L995S e I1527T foram significativamente associados à resistência a deltametrina e permetrina, respetivamente.

Significado
O artigo demonstra que o sequenciamento de amplicons multiplex de alto rendimento utilizando tecnologia de nanoporos é um método escalável e de baixo custo para a vigilância genómica de vetores de malária. Caracterizou com sucesso o panorama genético da resistência a inseticidas no Gana, revelando uma mistura complexa de variantes conhecidas e novas, e destacando a natureza dinâmica da evolução da resistência. Os resultados sublinham a necessidade de monitorização genómica contínua para informar a gestão da resistência a inseticidas direcionada e estratégias de controlo vetorial adaptativas, particularmente dado o evidência de alto fluxo génico que pode facilitar a rápida propagação de alelos de resistência através das zonas ecológicas.