LSD1 Expression is Associated with Immune Exclusion and Hypoxia-Related Transcriptional Programs in Triple-Negative Breast Cancer

Resumen Técnico: La expresión de LSD1 se asocia con la exclusión inmunitaria y programas transcripcionales relacionados con la hipoxia en el cáncer de mama triple negativo

Planteamiento del problema
El cáncer de mama triple negativo (CMTN) se caracteriza por una biología agresiva, altas tasas de recurrencia y una infiltración inmunitaria heterogénea. Si bien el bloqueo de puntos de control inmunitario ha beneficiado a un subgrupo de pacientes, muchos tumores de CMTN presentan un fenotipo de "exclusión inmunitaria" o "frío" con baja infiltración de células T, lo que limita la eficacia de la inmunoterapia. El regulador epigenético Lysine-specific demethylase 1 (LSD1/KDM1A) es conocido por impulsar programas oncogénicos y la resistencia terapéutica en el CMTN. Sin embargo, las asociaciones clínicas específicas entre la expresión de la proteína LSD1, los programas transcripcionales relacionados con la hipoxia, el contexto inmunológico espacial y la regulación transcripcional mediada por AP-1 en cohortes humanas de CMTN aún no han sido completamente definidas. Además, los efectos de la inhibición de LSD1 en modelos de organoides derivados de pacientes que incorporan componentes inmunitarios han sido menos explorados.

Metodología
El estudio empleó un enfoque multimodal que integra patología clínica, genómica, transcriptómica espacial y modelado funcional 3D:

• Análisis de cohortes clínicas: Se realizó inmunohistoquímica (IHC) en una micromatriz de tejido (TMA) de 337 especímenes de CMTN evaluables de Singapore General Hospital (2003–2014). La expresión nuclear de LSD1 se puntuó utilizando un H-score, estratificando los tumores en subconjuntos "LSD1 positivos" y "negativos". Los resultados de supervivencia (DFS y OS) se correlacionaron con el estado de LSD1.
• Transcriptómica y bioinformática: Se realizaron análisis de expresión diferencial de genes utilizando datos de RNA-seq institucionales y cohortes públicas (METABRIC, TCGA, FUSCC). Se utilizaron análisis de enriquecimiento de vías (ORA, GSEA) y análisis de redes (STRING, Cytoscape) para identificar firmas asociadas.
• Perfil epigenómico: Se realizó ChIP-seq en células de CMTN (MDA-MB-231) y líneas celulares de comparación para mapear los sitios de unión de LSD1 en todo el genoma; el análisis de enriquecimiento de motivos (HOMER) y la co-inmunoprecipitación se utilizaron para identificar interacciones de factores de transcripción. La ocupación de LSD1 también se intersectó con conjuntos de datos públicos de unión a la cromatina de HIF1A para evaluar las asociaciones con la hipoxia.
• Perfilado espacial: Se aplicó GeoMX Digital Spatial Profiling (DSP) a tejidos de CMTN para caracterizar las alteraciones inmunitarias específicas de cada compartimento (regiones de células B frente a regiones de células T) y las diferencias transcripcionales dentro de los tumores estratificados por LSD1.
• Validación funcional:
  • In vitro: Se utilizaron el silenciamiento mediante shRNA y la inhibición farmacológica (SP2509, fenelzina) en líneas celulares para evaluar los efectos sobre la proliferación, la metilación de histonas (H3K4me1/2, H3K9me1/2) y los marcadores inmunitarios (PD-L1, MHC Clase I).
  • Modelos de organoides 3D: Se cultivaron organoides de CMTN derivados de pacientes en monocultivo y co-cultivo con células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Los tratamientos con inhibidores de LSD1 se evaluaron para determinar la reducción del volumen tumoral y la viabilidad/infiltración de las células inmunitarias durante 96 horas.

Contribuciones clave y resultados

1. Correlación clínica con la exclusión inmunitaria y la baja supervivencia:

   • La alta expresión nuclear de LSD1 se asoció significativamente con una supervivencia global inferior.
   • Los tumores con alta expresión de LSD1 exhibieron un fenotipo distintivo de "exclusión inmunitaria", caracterizado por una reducción de la infiltración de células T CD3+, CD4+, CD8+, células B CD20+, células T/NKT-like CD3+CD56+ y macrófagos CD68+.
   • La expresión de PD-L1 fue menor en los tumores con alta expresión de LSD1, lo cual es consistente con un microambiente no inflamado.
   • La regresión de Cox multivariable confirmó la positividad de LSD1 como un factor pronóstico independiente.

2. Firmas transcripcionales y espaciales:

   • El análisis transcriptómico reveló un enriquecimiento de programas asociados a la hipoxia (HIF-1) y al MYC, junto con la supresión de las vías de interferón y de activación inmunitaria en los tumores con alta expresión de LSD1.
   • El perfilado espacial de GeoMX demostró una represión específica de compartimentos: los genes de la respuesta inmunitaria innata estaban subregulados en las regiones de células B, mientras que la señalización de interferón tipo I estaba suprimida en las regiones de células T.

3. Ocupación de la cromatina e interacción con AP-1:

   • El ChIP-seq identificó 2,807 sitios de unión de LSD1 de alta confianza en células de CMTN (significativamente más que en células de tipo normal).
   • El análisis de enriquecimiento de motivos reveló un fuerte enriquecimiento de motivos canónicos de AP-1 (JUN/FOS) dentro de las regiones ocupadas por LSD1.
   • La co-inmunoprecipitación confirmó una interacción física entre LSD1 y los miembros del complejo AP-1.
   • La integración con conjuntos de datos públicos de HIF1A sugirió una colocalización no aleatoria de LSD1 con candidatos a potenciadores (enhancers) distales asociados a la hipoxia, aunque esto se señaló como evidencia correlativa debido a las condiciones experimentales no emparejadas.

4. Identificación de genes candidatos:

   • La intersección de los picos de ChIP-seq de LSD1 con los genes expresados diferencialmente a través de las cohortes identificó 12 candidatos sobreexpresados y 13 subregulados, incluyendo SPPL2A y NCOA3, que están vinculados a la señalización inmunitaria y la regulación transcripcional.

5. Efectos funcionales de la inhibición:

   • El silenciamiento o la inhibición de LSD1 aumentó los niveles globales de H3K4me1/2 y H3K9me1/2 y redujo los niveles de las proteínas HIF-1α, VEGFA y MYC.
   • La inhibición farmacológica aumentó la expresión superficial de PD-L1 y MHC Clase I en las células de CMTN.
   • En los organoides derivados de pacientes, los inhibidores de LSD1 (SP2509, fenelzina) indujeron reducciones dependientes de la dosis en el volumen tumoral.
   • Crucialmente, en los ensayos de co-cultivo con PBMC, la inhibición de LSD1 redujo la carga tumoral sin depletar el recuento de células inmunitarias, lo que respalda un mecanismo de acción selectivo para el tumor compatible con la viabilidad de las células inmunitarias.

Significancia y afirmaciones
Los autores afirman que este estudio proporciona una evaluación integrativa que vincula la expresión de LSD1 en el CMTN con un fenotipo de exclusión inmunitaria, programas transcripcionales relacionados con la hipoxia y la ocupación de la cromatina enriquecida con motivos de AP-1. Los hallazgos sugieren que los estados asociados a LSD1 se correlacionan con una alteración de la inmunogenicidad tumoral.

El artículo posiciona a LSD1 como un biomarcador potencial para el CMTN agresivo e inmunológicamente "frío" y como una vulnerabilidad terapéutica candidata. Específicamente, el estudio respalda la hipótesis de que la inhibición de LSD1 puede modular las vías asociadas al sistema inmunitario y reducir el crecimiento tumoral preservando la viabilidad de las células inmunitarias en modelos 3D de corto plazo. Los autores concluyen que estos hallazgos multimodales apoyan la investigación adicional de estrategias dirigidas a LSD1, potencialmente en combinación con terapias existentes, para abordar la necesidad no cubierta en el CMTN inmunológicamente frío.

Limitaciones reconocidas por los autores
Los autores señalan explícitamente que el estudio es correlativo respecto a la causalidad entre LSD1, la hipoxia y la exclusión inmunitaria, ya que no se realizaron experimentos funcionales directos in vivo. La validación mecánica se restringió mayoritariamente a una sola línea celular (MDA-MB-231), y las conclusiones sobre la hipoxia dependen de firmas transcriptómicas en lugar de mediciones directas en tejido. Además, los co-cultivos de organoides-PBMC fueron de corto plazo (96 horas) y carecieron de especificidad de células T autólogas o componentes estromales, lo que limita las conclusiones sobre la modulación inmunitaria a largo plazo. Finalmente, aunque se detectaron el enriquecimiento de motivos de AP-1 y las interacciones físicas, la demostración formal de la dependencia funcional en loci específicos quedó fuera del alcance de este estudio.