LSD1 Expression is Associated with Immune Exclusion and Hypoxia-Related Transcriptional Programs in Triple-Negative Breast Cancer

技術要約：LSD1の発現は、トリプルネガティブ乳がんにおける免疫排除および低酸素関連の転写プログラムと関連している

問題提起
トリプルネガティブ乳がん（TNBC）は、攻撃的な生物学的特性、高い再発率、および不均一な免疫浸潤を特徴とする。免疫チェックポイント阻害薬は一部の患者に利益をもたらしているが、多くのTNBC腫瘍は「免疫排除型」または「コールド」な表現型を示し、T細胞の浸潤が乏しいため、免疫療法の有効性が制限されている。エピジェネティック制御因子であるリシン特異的脱メチル化酵素1（LSD1/KDM1A）は、TNBCにおける腫瘍形成プログラムや治療抵抗性を駆動することが知られている。しかし、ヒトTNBCコホートにおけるLSD1タンパク質の発現、低酸素関連の転写プログラム、空間的免疫コンテクチャー、およびAP-1介在性の転写調節の間の具体的な臨床的関連性は、まだ完全には定義されていない。さらに、免疫成分を組み込んだ患者由来オルガノイドモデルにおけるLSD1阻害の影響についても、十分に探索されていない。

方法論
本研究では、臨床病理学、ゲノミクス、空間的トランスクリプトミクス、および機能的3Dモデリングを統合したマルチモーダルなアプローチを採用した：

• 臨床コホート解析： シンガポール総合病院の評価可能なTNBC検体337例（2003–2014年）の組織マイクロアレイ（TMA）に対して免疫組織化学染色（IHC）を実施した。核内のLSD1発現をHスコアを用いて判定し、腫瘍を「LSD1陽性」および「陰性」のサブセットに層別化した。生存アウトカム（DFSおよびOS）をLSD1の状態と相関させた。
• トランスクリプトミクスおよびバイオインフォマティクス： 施設内のRNA-seqデータおよび公開コホート（METABRIC、TCGA、FUSCC）を用いて、差異発現解析を行った。パスウェイ濃縮解析（ORA、GSEA）およびネットワーク解析（STRING、Cytoscape）を用い、関連するシグネチャーを特定した。
• エピゲノム・プロファイリング： TNBC（MDA-MB-231）および比較対象の細胞株を用いてChIP-seqを実施し、ゲノムワイドなLSD1結合部位をマッピングした。モチーフ濃縮解析（HOMER）および共免疫沈降法を用いて、転写因子との相互作用を特定した。LSD1の占有部位を公開されているHIF1A結合データセットと交差させ、低酸素との関連性を評価した。
• 空間的プロファイリング： GeoMX Digital Spatial Profiling（DSP）をTNBC組織に適用し、コンパートメント特異的な免疫変化（B細胞領域 vs T細胞領域）およびLSD1で層別化された腫瘍内の転写の違いを特徴付けた。
• 機能的検証：
  • in vitro： shRNAによるノックダウンおよび薬理学的阻害（SP2509、フェネルジン）を用い、細胞の増殖、ヒストンメチル化（H3K4me1/2、H3K9me1/2）、および免疫マーカー（PD-L1、MHCクラスI）への影響を評価した。
  • 3Dオルガノイドモデル： 患者由来のTNBCオルガノイドを、単独培養および末梢血単核細胞（PBMC）との共培養条件下で培養した。LSD1阻害剤による腫瘍体積の減少および免疫細胞の生存率／浸潤への影響を96時間にかけて評価した。

主な貢献と結果

1. 免疫排除および生存率低下との臨床的相関：

   • 高い核内LSD1発現は、有意に劣悪な全生存期間と関連していた。
   • LSD1高発現腫瘍は、CD3+、CD4+、CD8+ T細胞、CD20+ B細胞、CD3+CD56+ T/NKT様細胞、およびCD68+マクロファージの浸潤減少を特徴とする、明確な「免疫排除型」表現型を示した。
   • PD-L1の発現はLSD1高発現腫瘍において低く、非炎症性の微小環境と一致していた。
   • 多変量Cox回帰分析により、LSD1陽性が独立した予後因子であることが確認された。

2. 転写および空間的シグネチャー：

   • トランスクリプトーム解析により、LSD1高発現腫瘍において、低酸素関連（HIF-1）およびMYC関連プログラムの濃縮、ならびにインターフェロンおよび免疫活性化経路の抑制が明らかになった。
   • GeoMX空間プロファイリングにより、コンパートメント特異的な抑制が示された。すなわち、B細胞領域では自然免疫応答遺伝子がダウンレギュレートされ、T細胞領域ではタイプIインターフェロンシグナルが抑制されていた。

3. クロマチン占有およびAP-1相互作用：

   • ChIP-seqにより、TNBC細胞において2,807個の高信頼性LSD1結合部位を特定した（正常様細胞よりも有意に多い）。
   • モチーフ濃縮解析により、LSD1が占有する領域内に、標準的なAP-1（JUN/FOS）モチーフの強い濃縮が認められた。
   • 共免疫沈降により、LSD1とAP-1複合体メンバーとの物理的な相互作用が確認された。
   • 公開されているHIF1Aデータセットとの統合により、LSD1と低酸素関連の遠位エンハンサー候補との非ランダムな共局在が示唆されたが、実験条件が一致していないため、これは相関的な証拠として扱われた。

4. 候補遺伝子の特定：

   • LSD1 ChIP-seqのピークと、各コホートにおける差異発現遺伝子の交差解析により、免疫シグナルおよび転写調節に関連するSPPL2AやNCOA3を含む、12個の上昇および13個の低下した候補遺伝子を特定した。

5. 阻害による機能的影響：

   • LSD1のノックダウンまたは阻害は、全般的なH3K4me1/2およびH3K9me1/2レベルを増加させ、HIF-1α、VEGFA、およびMYCのタンパク質レベルを減少させた。
   • 薬理学的阻害は、TNBC細胞におけるPD-L1およびMHCクラスIの表面発現を増加させた。
   • 患者由来オルガノイドにおいて、LSD1阻害剤（SP2509、フェネルジン）は用量依存的な腫瘍体積の減少を誘導した。
   • 決定的なことに、PBMC共培養アッセイにおいて、LSD1阻害は免疫細胞数を枯渇させることなく腫瘍負荷を減少させ、腫瘍選択的な作用機序が免疫細胞の生存性と両立可能であることを支持した。

意義および主張
著者らは、本研究がLSD1の発現を、免疫排除表現型、低酸素関連の転写プログラム、およびAP-1モチーフに富むクロマチン占有へと結びつける統合的な評価を提供すると主張している。これらの知見は、LSD1関連の状態が変化した腫瘍免疫原性と相関していることを示唆している。

本論文は、LSD1を、攻撃的な免疫コールド型のTNBCにおける潜在的なバイオマーカー、および治療標的としての脆弱性と位置付けている。具体的には、本研究は、LSD1阻害が免疫関連経路を調節し、短期間の3Dモデルにおいて免疫細胞の生存性を維持しながら腫瘍増殖を抑制できるという仮説を支持している。著者らは、これらのマルチモーダルな知見が、免疫コールド型のTNBCにおける未充足のニーズに対処するための、既存の治療法との併用を含むLSD1標的戦略のさらなる調査を支持すると結論付けている。

著者が認める限界事項
著者らは、LSD1、低酸素、および免疫排除の間の因果関係に関する本研究は相関的なものであり、直接的なin vivoでの機能実験は行われていないことを明示している。メカニズムの検証は主に単一の細胞株（MDA-MB-231）に限定されており、低酸素に関する結論は直接的な組織測定ではなく、トランスクリプトーム・シグネチャーに基づいている。さらに、オルガノイド-PBMC共培養は短期的（96時間）であり、自己のT細胞特異性やストローマ成分を欠いているため、長期的な免疫調節に関する結論には限界がある。最後に、AP-1モチーフの濃縮と物理的相互作用は検出されたものの、特定の遺伝子座における機能的依存性の正式な実証は、本研究の範囲を超えている。