Deep sequencing artificially inflates estimates of microbial diversity

Per comprendere il mondo invisibile che vive sulla nostra pelle, nel nostro suolo o all'interno del nostro intestino, gli scienziati si rivolgono spesso a una tecnica che agisce come un censimento genetico. Prelevano un campione, isolano il DNA dei minuscoli organismi presenti e utilizzano macchine per leggere il codice genetico di geni specifici che fungono da identificatori unici per ogni specie. Contando quante diverse versioni di questi geni appaiono in un campione, i ricercatori possono stimare quanti diversi tipi di microbi vivano lì. Questo metodo ha rivoluzionato la nostra visione del mondo microbico, rivelando comunità complesse che prima erano invisibili. Tuttavia, affinché questi conteggi siano significativi, i dati devono riflettere la realtà, non le stranezze della macchina che effettua il conteggio. Se la tecnologia stessa crea l'illusione di nuova vita dove non esiste, l'intera immagine della diversità microbica diventa distorta, portando gli scienziati a credere che una comunità sia molto più varia di quanto non sia realmente.

Uno studio recente affronta un modello preoccupante in cui l'atto stesso di guardare più a fondo in un campione sembra creare più vita di quanta ce ne sia effettivamente. I ricercatori hanno iniziato testando uno scenario semplice e controllato: hanno preso campioni che contenevano un solo tipo di sequenza genetica, il che significava che c'era zero diversità fin dall'inizio. Questi campioni a "zero diversità" sono stati creatati utilizzando geni dell'ospite che non variano molto o utilizzando filamenti sintetici di DNA aggiunti al mix. Quando queste campioni uniformi sono stati sequenziati, i risultati sono stati sorprendenti. Invece di vedere un solo tipo di sequenza, le macchine hanno riportato centinaia di varianti diverse. Il problema è peggiorato man mano che i ricercatori aumentavano il numero di letture, ovvero il volume totale di dati raccolti. Quando il sequenziamento ha superato le cento mila letture, il numero di varianti false è esploso esponenzialmente. Sembrava che la macchina stesse inventando nuove specie dal nulla, semplicemente perché stava guardando con troppa intensità e per troppo tempo.

Questa inflazione artificiale non era limitata ai tubi da laboratorio controllati. Quando i ricercatori hanno applicato la stessa analisi a campioni microbici reali, come quelli contenenti batteri o funghi, hanno riscontrato lo stesso schema. All'aumentare del numero di letture, la diversità calcolata della comunità aumentava, anche quando la reale composizione biologica del campione rimaneva invariata. Lo studio ha dimostrato che questo errore non influenzava solo il conteggio totale delle specie, ma anche la varietà percepita all'interno di specifici gruppi di organismi. I ricercatori hanno scoperto che questo problema era coerente attraverso i diversi tipi di marcatori genetici utilizzati per identificare i microbi, suggerendo una sfida fondamentale nel modo in cui le attuali tecnologie di sequenziamento gestiscono grandi volumi di dati.

Il team ha indagato se specifici aggiustamenti potessero risolvere il problema. Hanno testato l'accorciamento della lunghezza delle sequenze genetiche lette dalla macchina e hanno provato a utilizzare una piattaforma di sequenziamento diversa, nota come AVITI Element. Sebbene questi cambiamenti abbiano aiutato a ridurre il numero di varianti false, non hanno eliminato del tutto il problema. L'inflazione artificiale persisteva, sebbene in forma ridotta. Gli autori concludono che la soluzione più pratica per ora sia essere estremamente cauti quando si confrontano campioni che sono stati sequenziati a profondità molto diverse. Se un campione è stato letto un milione di volte e un altro solo mille volte, il primo apparirà quasi certamente più diversificato, non perché lo sia, ma perché la macchina ha avuto più opportunità di generare errori. Lo studio suggerisce che l'uso di questi campioni controllati a zero diversità come termine di riferimento possa aiutare gli scienziati a calibrare i loro metodi per avvicinarsi alla verità, garantendo che le mappe del mondo microbico che disegnano siano basate su ciò che è realmente presente, piuttosto che su ciò che la macchina immagina.