Deep sequencing artificially inflates estimates of microbial diversity

Para compreender o mundo invisível que vive na nossa pele, no nosso solo ou dentro do nosso intestino, os cientistas frequentemente recorrem a uma técnica que atua como um censo genético. Eles coletam uma amostra, isolam o DNA dos minúsculos organismos presentes e utilizam máquinas para ler o código genético de genes específicos que servem como identificadores únicos para cada espécie. Ao contar quantas versões diferentes desses genes aparecem em uma amostra, os pesquisadores podem estimar quantos tipos diferentes de micróbios estão vivendo ali. Este método revolucionou a nossa visão do mundo microbial, revelando comunidades complexas que eram anteriormente invisíveis. No entanto, para que essas contagens sejam significativas, os dados devem refletir a realidade, não as peculiaridades da máquina que realiza a contagem. Se a própria tecnologia criar a ilusão de nova vida onde ela não existe, toda a imagem da diversidade microbial torna-se distorcida, levando os cientistas a acreditar que uma comunidade é muito mais variada do que realmente é.

Um estudo recente aborda um padrão preocupante onde o próprio ato de olhar mais profundamente em uma amostra parece criar mais vida do que realmente existe. Os pesquisadores começaram testando um cenário simples e controlado: eles pegaram amostras que continham apenas um tipo de sequência genética, o que significa que havia zero diversidade para começar. Essas amostras de "zero diversidade" foram criadas usando genes de hospedeiros que não variam muito ou usando fitas sintéticas de DNA adicionadas à mistura. Quando essas amostras uniformes foram sequenciadas, os resultados foram surpreendentes. Em vez de ver apenas um tipo de sequência, as máquinas reportaram centenas de variantes diferentes. O problema piorava à medida que os pesquisadores aumentavam o número de leituras, ou o volume total de dados coletados. Assim que o sequenciamento ultrapassou cem mil leituras, o número de variantes falsas explodiu exponencialmente. Parecia que a máquina estava inventando novas espécies do nada, simplesmente porque estava olhando tão intensamente e por tanto tempo.

Essa inflação artificial não se limitou aos tubos de ensaio controlados. Quando os pesquisadores aplicaram a mesma análise a amostras microbianas reais, como aquelas contendo bactérias ou fungos, encontraram o mesmo padrão. À medida que o número de leituras aumentava, a diversidade calculada da comunidade subia, mesmo quando a composição biológica real da amostra permanecia inalterada. O estudo mostrou que esse erro afetava não apenas a contagem total de espécies, mas também a variedade percebida dentro de grupos específicos de organismos. Os pesquisadores descobriram que este problema era consistente em diferentes tipos de marcadores genéticos usados para identificar micróbios, sugerindo um desafio fundamental na forma como as tecnologias de sequenciamento atuais lidam com grandes volumes de dados.

A equipe investigou se ajustes específicos poderiam corrigir o problema. Eles testaram o encurtamento do comprimento das sequências genéticas lidas pela máquina e tentaram usar uma plataforma de sequenciamento diferente, conhecida como AVITI Element. Embora essas mudanças tenham ajudado a reduzir o número de variantes falsas, elas não eliminaram o problema inteiramente. A inflação artificial persistiu, embora de forma menor. Os autores concluem que a solução mais prática por enquanto é ser extremamente cuidadoso ao comparar amostras que foram sequenciadas com profundidades muito diferentes. Se uma amostra foi lida um milhão de vezes e outra apenas mil vezes, a primeira quase certamente parecerá mais diversa, não porque o seja, mas porque a máquina teve mais oportunidades de gerar erros. O estudo sugere que o uso dessas amostras controladas de zero diversidade como um padrão de referência pode ajudar os cientistas a ajustar seus métodos para chegarem mais perto da verdade, garantindo que os mapas do mundo microbial que eles desenham sejam baseados no que realmente está lá, e não no que a máquina imagina.