Deep sequencing artificially inflates estimates of microbial diversity

Om de onzichtbare wereld te begrijpen die op onze huid, in onze bodem of in onze darmen leeft, wenden wetenschappers zich vaak tot een techniek die fungeert als een genetische volkstelling. Ze nemen een monster, isoleren het DNA van de aanwezige minuscule organismen en gebruiken machines om de genetische code van specifieke genen te lezen die fungeren als unieke identificatiekenmerken voor elke soort. Door te tellen hoeveel verschillende versies van deze genen in een monster voorkomen, kunnen onderzoekers schatten hoeveel verschillende soorten microben daar leven. Deze methode heeft ons zicht op de microbiële wereld gerevolutioneerd door complexe gemeenschappen te onthullen die voorheen onzichtbaar waren. Echter, om deze tellingen betekenisvol te zijn, moet de data de werkelijkheid weerspiegelen, en niet de eigenaardigheden van de machine die de telling uitvoert. Als de technologie zelf de illusie van nieuw leven creëert waar dat niet is, wordt het hele beeld van microbiële diversiteit vervormd, waardoor wetenschappers gaan geloven dat een gemeenschap veel gevarieerder is dan zij werkelijk is.

Een recente studie pakt een verontrustend patroon aan waarbij de handeling van het dieper kijken in een monster lijkt meer leven te creëren dan er daadwerkelijk aanwezig is. De onderzoekers begonnen door een eenvoudig, gecontroleerd scenario te testen: ze namen monsters die slechts één type genetische sequentie bevatten, wat betekende dat er van begin af aan nul diversiteit was. Deze "nul-diversiteit"-monsters werden gemaakt met behulp van gastheergenen die weinig variëren of door synthetische DNA-strengen aan het mengsel toe te voegen. Wanneer deze uniforme monsters werden gesequenced, waren de resultaten verbijsterend. In plaats van slechts één type sequentie te zien, rapporteerden de machines honderden verschillende varianten. Het probleem verergerde naarmate de onderzoekers het aantal 'reads', oftewel het totale volume aan verzamelde data, verhoogden. Zodra de sequencing voorbij de honderdduizend reads ging, explodeerde het aantal valse varianten exponentieel. Het leek alsof de machine nieuwe soorten uit het niets uitvond, simpelweg omdat de machine zo hard en zo lang zocht.

Deze kunstmatige inflatie beperkte zich niet tot de gecontroleerde reageerbuizen. Toen de onderzoekers dezelfde analyse toepasten op echte microbiële monsters, zoals die met bacteriën of schimmels, vonden zij hetzelfde patroon. Naarmate het aantal reads toenam, steeg de berekende diversiteit van de gemeenschap, zelfs wanneer de werkelijke biologische samenstelling van het monster ongewijzigd bleef. De studie toonde aan dat deze fout niet alleen de totale telling van soorten beïnvloedde, maar ook de waargenomen variëteit binnen specifieke groepen organismen. De onderzoekers ontdekten dat dit probleem consistent was over verschillende soorten genetische markers die gebruikt worden om microben te identificeren, wat wijst op een fundamentele uitdaging in de manier waarop huidige sequencingtechnologieën grote volumes aan data verwerken.

Het team onderzocht of specifieke aanpassingen het probleem konden oplossen. Ze testten het verkorten van de lengte van de genetische sequenties die door de machine gelezen worden en probeerden een ander sequencingplatform dat bekend staat als de AVITI Element te gebruiken. Hoewel deze wijzigingen hielpen het aantal valse varianten te verminderen, elimineerden ze het probleem niet volledig. De kunstmatige inflatie bleef bestaan, zij het in kleinere vorm. De auteurs concluderen dat de meest praktische oplossing voor nu is om uiterst voorzichtig te zijn bij het vergelijken van monsters die met zeer verschillende dieptes zijn gesequenced. Als het ene monster een miljoen keer is uitgelezen en het andere slechts duizend keer, zal het eerste bijna zeker diverser lijken, niet omdat het dat is, maar omdat de machine meer kansen heeft gehad om fouten te genereren. De studie suggereert dat het gebruik van deze gecontroleerde, nul-diversiteit monsters als ijkpunt wetenschappers kan helpen hun methoden af te stemmen om dichter bij de waarheid te komen, zodat de kaarten van de microbiële wereld die zij tekenen gebaseerd zijn op wat er daadwerkelijk is, in plaats van op wat de machine zich inziet.